Ion Torrent推出僅需6個小時的AmpliSeq Exome試劑

Life Technologies旗下Ion Torrent推出外顯子組捕獲試劑，該試劑采用了AmpliSeq技術(shù)，將工作流程時間減至6小時（含1小時手控時間），并能進(jìn)行50毫微克的樣本輸入。

作為早期使用用戶，Selah Genomics基因組服務(wù)部副總裁Jeremy Stuart告訴《測序》期刊，其仍在對試劑的數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行評估，經(jīng)過初檢，該試劑“表現(xiàn)符合預(yù)期”。 從工作流程來看，該試劑“操作簡單、使用方便”。

Stuart補充說，采用其他外顯子組捕獲試劑需要2至3天才能制作出文庫，而使用該試劑，Selah的研究人員能在一天之內(nèi)就制作出文庫�！昂翢o疑問，該試劑更快捷、更省力”， Stuart說。

Stuart表示，下一步是將AmpliSeq外顯子組捕獲試劑與混合使用的試劑,如Agilent（安捷倫）的SureSelect試劑或HaloPlex試劑以及, Life Tech將后續(xù)提供的，用于Ion的TargetSeq外顯子組捕獲試劑進(jìn)行比較。

Life Tech不是唯一一家力圖解決周轉(zhuǎn)時間和限制外顯子組捕獲樣本輸入等問題的公司。Agilent（安捷倫）和Illumina均分別研發(fā)出試劑，以解決上述問題。使用Agilent（安捷倫）HaloPlex試劑的用戶報告說，該試劑需要3天的周轉(zhuǎn)時間，是使用SureSelect試劑時間的一半，最初可以輸入200毫微克樣本（IS 3/19/2013）。 同時，Illumina聲稱其Nextera Rapid Capture Exome試劑能夠在1.5天內(nèi)對96個樣本進(jìn)行樣本制備和外顯子組富集捕獲，以及進(jìn)行50毫微克DNA輸入。

AmpliSeq Exome試劑含有300,000個擴增子，可以復(fù)用到12個具有24,000個擴增子的擴增子池。 這12個擴增子池分別進(jìn)行單獨的PCR反應(yīng)，隨后組合成單一反應(yīng)，此時，也進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的AmpliSeq反應(yīng)，Life Tech產(chǎn)品營銷部高級主管Andy Felton告訴IS。

在研制外顯子組試劑時，主要的技術(shù)障礙是在保持均勻覆蓋的同時復(fù)用24,000個擴增子，F(xiàn)elton補充說。我們尚不需要對AmpliSeq文庫制備做重大改變，公司僅需對文庫制備的One Touch II機器進(jìn)行優(yōu)化，并稍微改進(jìn)部分生物學(xué)信息，以確保能對變異進(jìn)行準(zhǔn)確分析，F(xiàn)elton解釋說。

保持均勻覆蓋的一項關(guān)鍵之處在于確保緊挨的擴增子處于不同的擴增子池中，F(xiàn)elton說，“當(dāng)我們繪制特定基因時，我們希望獲得最佳的覆蓋率，因此，必須將彼此緊挨的擴增子分離至單獨的擴增子池”。 這與公司在其他AmpliSeq面板中使用的原理相同，但是，“由于達(dá)成24,000-個擴增子叢和300,000對擴增子引物，這使AmpliSeq Exome試劑更上一層樓”，F(xiàn)elton補充說。

12個擴增子池分別進(jìn)行單獨的PCR反應(yīng)，隨后匯集在同一池中。

Felton解釋說，如果用戶在Ion Proton PI芯片上運行兩個外顯子組，各反應(yīng)的試劑成本約750美元，包括外顯子組捕獲、文庫試劑、模板試劑、測序試劑和芯片。如果用戶購買了進(jìn)行48個反應(yīng)的試劑，則各反應(yīng)將花費400美元左右。

Felton說，當(dāng)在PI芯片上運行單個外顯子組時，該試劑可以以10倍的速度覆蓋98%的文庫，以及以20倍的速度覆蓋96%的文庫。 此外，0.2倍平均覆蓋率范圍內(nèi)的文庫覆蓋率高達(dá)90%。

對于在一個芯片上運行兩個外顯子組的用戶而言，該試劑可以以10倍的速度覆蓋98%的文庫，以及以20倍的速度覆蓋94%的文庫。如運行三個外顯子組，則該試劑可以以10倍的速度覆蓋94%的文庫，以及以20倍的速度覆蓋88%的文庫。

這便于用戶在孟德爾研究中在單個PI芯片上運行三個外顯子組，或者運行一個外顯子組以獲得更高的覆蓋率，F(xiàn)elton解釋說。

從DNA到外顯子組注釋變異的整個工作流程可以在兩天內(nèi)完成，其中，外顯子組文庫制備需6個小時，測序時間為3小時，F(xiàn)elton補充說。

Selah Genomics的Stuart表示，截至目前，公司已采用該試劑制作了8個外顯子組文庫。 盡管其尚未完成數(shù)據(jù)分析，到目前為止，覆蓋情況良好，目標(biāo)區(qū)域的覆蓋率高達(dá)90%。 此外，“以20倍或更高倍的速度進(jìn)行覆蓋，覆蓋率也在90%的范圍內(nèi)”， Stuart說，其目前正在外顯子組數(shù)據(jù)中尋找一種適合的質(zhì)量指標(biāo)。

Stuart表示，該試劑操作簡單、方便快捷，非常具有吸引力。

“如涉及我們希望開展的外顯子組測序數(shù)量，限制因素之一通常在于工作流程和費用”， Stuart補充說，“就工作流程而言，[采用AmpliSeq Exome試劑]，目前我們已可以開始處理大量樣本”。

由于Selah Genomics的研究人員已經(jīng)有過使用其他Ion AmpliSeq面板的經(jīng)驗，因此，轉(zhuǎn)為采用AmpliSeq Exome時并無困難，Stuart說。

與采用混合試劑進(jìn)行外顯子組測序的方法相比，擴增子法的一個優(yōu)勢體現(xiàn)在輸入數(shù)量很小，約100毫微克，Stuart說。 此外，擴增子法僅需進(jìn)行一次擴增——盡管Ion提供了進(jìn)行二次擴增的機會——而混合法卻需要進(jìn)行兩次擴增。

Stuart表示，其將把AmpliSeq Exome試劑主要用于腫瘤應(yīng)用中。最初，Stuart將該試劑用于尋找胚系突變。但是，最終其對在同一芯片上運行腫瘤和正常外顯子組以尋找罕見的體細(xì)胞突變倍感興趣。

Stuart說，在推出AmpliSeq Exome試劑后，其計劃將AmpliSeq Exome試劑與Proton PII芯片結(jié)合使用，這將“為同時運行腫瘤和正常外顯子組以及檢測罕見的體細(xì)胞突變提供了契機”。

除Ion Proton外，Selah Genomics還運行了Ion Torrent PGM、Illumina的MiSeq、454 GS FLX和 Pacific Bioscience的RS。

Stuart表示，Selah Genomics主要關(guān)注腫瘤學(xué)和病毒學(xué)。Selah Genomics使用Proton運行AmpliSeq的綜合癌癥面板，并根據(jù)AmpliSeq的熱點面板發(fā)起一項名為“PrecisionPath”的實驗室開發(fā)測試。 公司已與南卡羅來納州的格林維爾醫(yī)療系統(tǒng)公司（Greenville Health System）開展合作，以向癌癥患者提供該項測試(CSN 5/8/2013)。

此外，Selah還通過使用PGM和MiSeq進(jìn)行伴隨試驗，為制藥公司的臨床試驗提供支持，Stuart補充說。

Stuart表示，實驗室自5月起購入Proton，每次運行通常產(chǎn)生8到11千兆堿基，基本與其他用戶報告的數(shù)量相等（IS 2/26/2013）。 當(dāng)一次運行兩個外顯子組文庫時，以20倍或更高倍速度對目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行的覆蓋，覆蓋率可高達(dá)近90%，Stuart說，“這使得我們能一次運行一對外顯子組，胚系突變也得到充分覆蓋”。