同立海源新品試用：GMP級基因編輯利器CAS9核酸酶

CRISPR-Cas9是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御，可對抗入侵的病毒及外源DNA，可以將入侵噬菌體和質(zhì)粒DNA的片段整合到CRISPR序列中，通過相應的CRISPR RNAs（crRNAs）來指導Cas9蛋白對同源序列的降解，進而提供免疫性。根據(jù)CRISPR/Cas系統(tǒng)的特性，科學家將其改造成了目前最高效的基因組編輯工具。

2012年，Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以在體外切割雙鏈DNA；2013年，張鋒首次用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在原核生物 (大腸桿菌) 中實現(xiàn)基因組編輯。目前應用最廣泛的CRISPR/Cas9系統(tǒng)是來源于化膿性鏈球菌的CRISPR/Cas9系統(tǒng)。

CRISPR-Cas9系統(tǒng)由三個原件構(gòu)成：tracrRNA+crRNA嵌合成的sgRNA（single guide RNA）+宿主DNA序列上的PAM序列（protospacer adjacent motif）+Cas9剪刀（最常用的是化膿性鏈球菌來源的SpCas9蛋白）。sgRNA引導Cas9剪刀到與sgRNA的5’末端堿基互補的（長約20nt的）靶序列處，緊接這段互補序列下游若存在能被Cas9蛋白識別的PAM序列（SpCas9特異性識別的PAM是由3bp組成的NGG序列，N代表任意堿基），Cas9剪刀就會用兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域HNH和RuvC（在3～4nt upstream of PAM的位點）剪開DNA兩條鏈，最終形成雙鏈斷裂double-strandedbreak (DSB)。

圖片來源于網(wǎng)絡(luò)

基因敲除（Knock-out）  簡稱KO

Cas9蛋白可以對靶基因組進行剪切，形成DNA的雙鏈斷裂。在通常情況下，細胞會采用高效的非同源末端連接方式對斷裂的DNA進行修復。但是，在修復過程中通常會發(fā)生堿基插入或缺失的錯配現(xiàn)象，造成移碼突變使靶標基因失去功能，從而實現(xiàn)基因敲除。為了提高CRISPR系統(tǒng)的特異性，可將Cas9的一個結(jié)構(gòu)域進行突變，形成只能對DNA單鏈進行切割造成DNA缺口的Cas9核酸酶，想要形成雙鏈斷裂的效果可以設(shè)計兩條sgRNA序列，兩條sgRNA特異性的靶向結(jié)合DNA互補的兩條鏈的靶標序列，即可形成DNA斷裂，并在修復過程中通過移碼突變實現(xiàn)基因敲除。

基因敲入（Knock-in） 簡稱KI

當DNA雙鏈斷裂后，如果有DNA修復模板進入到細胞中，基因組斷裂部分會依據(jù)修復模板進行同源重組修復（HDR），從而實現(xiàn)基因敲入。HDR修復模式在細胞中發(fā)生率較低，通常小于10%。為了增加基因敲入的成功率，目前有很多科學家致力于提高HDR效率，將編輯的細胞同步至HDR最活躍的細胞分裂時期，促進修復方式以HDR進行；或者利用化學方法抑制基因進行NHEJ，提高HDR的效率。

多重編輯（Multiplex Editing）

將多個sgRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到細胞中，可同時對多個基因進行編輯，具有基因組功能篩選作用。多重編輯的應用包括：使用雙Cas9 nickases提高基因敲除的準確率、大范圍的基因組缺失及同時編輯不同的基因。通常情況下，一個質(zhì)粒上可以構(gòu)建2～7個不同的sgRNA進行多重CRISPR基因編輯。

功能基因組篩選

目前CRISPR的基因組篩選功能應用于篩選對表型有調(diào)節(jié)作用的相關(guān)基因，如對化療藥物或者毒素產(chǎn)生抑制的基因、影響腫瘤遷移的基因以及構(gòu)建病毒篩選文庫對潛在基因進行大范圍篩選等。