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細(xì)胞培養(yǎng)過程中的隱形污染（支原體）是普遍的問題，面對(duì)支原體污染帶來的巨大難題，世界各國開始重視，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了質(zhì)量控制，得到了有效控制。

支原體是什么？

支原體是目前已知一類能在無生命培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖的最小的原核細(xì)胞微生物，無細(xì)胞壁，直徑為0.1-0.3μm，且形態(tài)易變，極易通過除菌過濾器。大部分支原體繁殖速度比細(xì)菌慢，細(xì)胞培養(yǎng)過程中遇到的支原體95%都來自于以下四種支原體：口腔支原體、精氨酸支原體、豬鼻支原體、萊氏無膽甾支原體，其中萊氏無膽甾支原體為牛源性。

采用常規(guī)的顯微鏡無法直接觀察到支原體，當(dāng)細(xì)胞（特別是傳代細(xì)胞）被支原體污染后，細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA及蛋白表達(dá)發(fā)生改變，而細(xì)胞的生長(zhǎng)率一般并未發(fā)生顯著的影響，因而細(xì)胞被支原體污染一般難以察覺。因此細(xì)胞都需要定期（如每個(gè)月）進(jìn)行支原體污染的檢測(cè)。

如何判斷細(xì)胞是否被支原體感染？

一般根據(jù)支原體種類不同，采取不同的方法進(jìn)行檢測(cè)。目前常用的檢測(cè)方法有：培養(yǎng)法、 ELISA、直接或間接的熒光染色、PCR法等，其中，前面幾種靈敏度、培養(yǎng)周期等都較長(zhǎng)，對(duì)于普通養(yǎng)細(xì)胞的人來說不太實(shí)用。目前 PCR法靈敏度最高。且耗時(shí)較短。操作簡(jiǎn)單、可一次做多個(gè)細(xì)胞樣本。

PCR法是20世紀(jì)80年代中期建立起來的一種體外DNA 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，其基本原理是酶促DNA合成反應(yīng)，即在DNA模板、引物和脫氧核糖核酸存在下，經(jīng)DNA聚合酶的作用，使DNA鏈擴(kuò)增延伸。

支原體檢測(cè)試劑盒圖（貨號(hào)：ZQ505-K） 
 

1、Myco-PCR-Mix中加入了電泳測(cè)試時(shí)所需的色素試劑（藍(lán)色和黃色色素），PCR 反應(yīng)完畢后可以直接進(jìn)行凝膠電泳，反應(yīng)液呈現(xiàn)鮮艷的綠色。這種預(yù)混液方案操作簡(jiǎn)便，可最大限度地減少人為誤差，在較短時(shí)間內(nèi)即可獲得檢測(cè)結(jié)果。

2、本產(chǎn)品克服了PCR 反應(yīng)配置過程中的繁瑣程序，通過加入抑制非特異性結(jié)合的 cocktail，有效的整合了所有PCR反應(yīng)成分，實(shí)現(xiàn)了一步法 PCR 技術(shù)新的突破。

3、引物

我司的引物序列通過參考文獻(xiàn)和查閱大量信息和驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)相對(duì)市面上的引物，我司引物靈敏度更高。

通過對(duì)比不同品牌的支原體檢測(cè)試劑盒,結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性樣本在同一塊膠體上是有一定差異的。陽性樣本經(jīng)過3、9、27倍數(shù)稀釋后試劑盒A仍然能夠明確的檢測(cè)出來，且弱陽性條帶也相對(duì)其他試劑盒更突出。

（以下是重復(fù)3上次檢測(cè)后提供的參考圖）

樣本1為陽性樣本3倍稀釋、樣本2為陽性9倍稀釋、樣本3為陽性27倍稀釋、樣本4為弱陽性、樣本5為弱陽性、樣本6為陽性對(duì)照、樣本4為陰性對(duì)照性。Maker為1500bp

實(shí)驗(yàn)樣本：

用于檢測(cè)支原體的樣品是接種后進(jìn)行 3-6 天細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)上清液。如果使用常用的細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)上清可直接加入到 PCR 反應(yīng)液中。如果使用細(xì)胞懸濁液作為樣品，則需要提取 DNA，再進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)步驟

反應(yīng)體系：    Myco-PCR-Mix           24ul

                     待檢測(cè)細(xì)胞上清液          1ul

按照以上反應(yīng)比例，在PCR管中將待檢測(cè)樣品上清液 1ul加入到24 Myco-PCR-Mix中，每次檢測(cè)請(qǐng)用Positivecontrol模版作為陽性對(duì)照，用Negative control模版作為陰性對(duì)照。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5min，（95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 90s）30 個(gè)循環(huán)，72℃ 5min， 40℃ 保存。PCR產(chǎn)物跑1.5 % 瓊脂膠，用DL2000的DNA Marker顯示片段大小。

檢測(cè)結(jié)果

待檢測(cè)樣品中如果出現(xiàn)與陽性對(duì)照大小一致（450-600 bp）的條帶，說明樣品被支原體感染。
 

如果您的細(xì)胞不幸感染了支原體，最最最好的處理方式是立即丟棄該細(xì)胞，并對(duì)培養(yǎng)箱、超凈臺(tái)等設(shè)施及場(chǎng)所進(jìn)行消毒滅菌。因?yàn)橹г�體的傳播非常隱秘，相關(guān)研究表明其甚至能通過氣溶膠傳播。當(dāng)然，如果您的細(xì)胞非常珍貴或者不能再獲得，可以嘗試使用抑制支原體的藥物進(jìn)行處理，嘗試消除支原體污染。

這個(gè)過程一般周期較長(zhǎng)，因?yàn)槭褂盟幬锾幚頃r(shí)需配合多次大比例連續(xù)傳代來提高成功率。堅(jiān)持，就是勝利！

支原體清除試劑盒（貨號(hào)：CSP037）
 

1、本試劑含有兩種有效的針對(duì)支原體的抗生素，抑制或清除支原體的效果通常會(huì)更強(qiáng)一些，其作用機(jī)制是通過干擾核糖體轉(zhuǎn)運(yùn)而抑制蛋白質(zhì)的合成

1、推薦使用比例為 1:200，例如 5 mL 的完全培養(yǎng)基加入 25 μ  L 支原體抑制劑混勻；

2、棄去舊的培養(yǎng)基（貼壁細(xì)胞） ，用無菌的緩沖溶液將細(xì)胞清洗干凈， 再加入含有支原體抑制劑的新鮮培養(yǎng)基；

3、根據(jù)細(xì)胞增殖情況更換含有抑制劑的培養(yǎng)基或傳代； 一般加入抑制劑后3天左右， 會(huì)出現(xiàn)明顯 的效果， 連續(xù)使用兩周后建議用支原體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。若細(xì)胞污染非常嚴(yán)重時(shí)，需延長(zhǎng)使用時(shí)間。

4、環(huán)境、試劑耗材等可能一直存在污染源，建議需定期進(jìn)行支原體檢測(cè)。
 

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1、活動(dòng)日期：2024年4月1日-2024年4月30日
2、活動(dòng)對(duì)象：僅限終端客戶參與活動(dòng)
3、一個(gè)課題組只能參加一次
3、本活動(dòng)最終解釋權(quán)歸中喬新舟所有