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病理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究
HE與特殊染色，細(xì)胞凋亡Tune檢測(cè)，激光共聚焦檢測(cè)，免疫細(xì)胞化學(xué)ICC，免疫熒 光IF，免疫組化IHC。
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實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理：IP是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌蛋白質(zhì)的“prorein A"特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的FC片段的現(xiàn)象活用開發(fā)出來的方法。目前多用精制的prorein A預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的prorein A就能吸附抗原達(dá)到精制的目的。
實(shí)驗(yàn)操作流程：
1.樣品準(zhǔn)備：
1）取細(xì)胞加入500μl上樣Buffer(無溴酚藍(lán))和50ul 10mg/ml PMSF，混勻，超聲波破碎細(xì)胞
2）4℃，12000rpm離心10min
3）取上清夜，-70℃凍存24hr
5）4℃ 12000rpm再次離心10min，取上清分裝，一份用于定蛋白，另一份加入溴酚藍(lán)(0.1%(W/V))后于100℃加熱4min，后于-20℃保存待用。
2.定蛋白及計(jì)算電泳上樣量：根據(jù)總蛋白測(cè)定試劑盒說明書操作測(cè)定樣本中的總蛋白含量，電泳上樣量定為40ug
3.免疫沉淀：
1）準(zhǔn)備A蛋白-Sepharose珠：用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠
2）準(zhǔn)備A蛋白-Sepharose珠.一抗復(fù)合物：按每50 μl A蛋白-Sepharose珠中加入10ul 一抗，4℃孵育1 h，8000rpm離心5 min，PBS洗滌3次，加50ulPBS
3）取100 μg總蛋白，加入50ul A蛋白-Sepharose珠.一抗復(fù)合物，4℃輕搖2h，PBS洗滌3次，之后加入50ul 1×SDS凝膠上樣緩沖液，100℃變性3 min，以游離抗原、抗體、珠子，8000 rpm室溫離心5 min，蛋白上清儲(chǔ)于-20℃?zhèn)溆谩?/font>
4.電泳：
1）安裝好電泳裝置
2）根據(jù)不同的指標(biāo)配制相應(yīng)濃度的分離膠，灌膠約3/5體積，液封 (<10%用0.1%SDS,>10%用異丙醇)
3）30min后，待凝后傾去封液
4）配5%的濃縮膠，灌膠至距平板頂部2mm處，插入梳子, 30min后，待凝后拔出梳子，用去離子水清洗加樣孔，用濾紙吸干
5）上樣：各樣品取50ug上樣，marker取10μl上樣(上樣前需按說明書進(jìn)行預(yù)處理)
6）緩慢加入內(nèi)、外槽緩沖液，接通電源，90v電泳至指示劑進(jìn)入分離膠后，調(diào)電壓至150V繼續(xù)電泳
7）當(dāng)指示劑距平板底端1cm處時(shí)停止電泳
5.轉(zhuǎn)膜及檢測(cè):
1）準(zhǔn)備2個(gè)Φ12cm的平面皿，一個(gè)裝去離子水浸泡NC膜 20min，另一裝轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡海綿和濾紙20min
2）取下膠，切除濃縮膠部分后，將分離膠浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中約 5min
3）按順序安裝好轉(zhuǎn)膜裝置（黑色板-海綿-三層濾紙-凝膠-硝酸纖維膜-三層濾紙-海綿-紅色板）
4）完全排除氣泡， 4℃，100mA轉(zhuǎn)膜2hr。
5）傾去轉(zhuǎn)膜緩沖液，拆除轉(zhuǎn)膜裝置，將硝酸纖維膜放入麗春紅中搖床染色15min，用去離子水清洗至能看到條帶，后用鉛筆標(biāo)出marker位置，再用去離子水震蕩以去除浮色。在右上角剪去一角以辨上下左右
6）將膜轉(zhuǎn)移至另一容器中，用5%脫脂奶粉封閉, 4℃過夜
7）將膜轉(zhuǎn)移至盡可能小的容器中并加入稀釋好的一抗
8）37℃搖床孵育約2hr
9）PBST洗滌4次，每次5min
10）將膜轉(zhuǎn)移至盡可能小的容器中并加入稀釋好的二抗，37℃搖床孵育約30min
11）PBST洗滌4次，每次5min
12）將膜轉(zhuǎn)移至盡可能小的容器中并加入預(yù)先配制好的化學(xué)發(fā)光底物（A液與B液等體積混和），室溫孵育5min后
13）取出NC膜，去盡殘液，包好，放入X-光片夾中顯影
14）掃描及分析
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