76種基因敲除大鼠品系,包括APOE、LDLR、APP、HTT、Leptin、P53等經典疾病模型,以及超過500種基因敲除小鼠品系。
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康威達基因科技有限公司目前通過優(yōu)化的TALEN技術通過注射受精卵的方式實現(xiàn)大、小鼠的基因打靶。相比傳統(tǒng)的技術效率更高,胚胎干細胞系容易建立。已成功開發(fā)出76種基因敲除大鼠品系,包括APOE、LDLR、APP、HTT、Leptin、P53等經典疾病模型,另外已擁有超過500種基因敲除小鼠品系。
TALEN基因敲除基本流程:
1. 確定靶點:選擇目標基因外顯子中相隔17-18bp的兩段14-18bp序列作為靶點
2. TAL靶點識別域的克隆構建
3. 將TAL靶點識別域克隆入特定的真核表達載體
4. 將重組真核表達質粒轉入(卵)細胞以表達重組核酸酶,敲除基因
5. 篩選突變體
TALEN的構建
TALEN由四部分組成:N端序列,RVDs,C端序列,F(xiàn)okI。利用Type II 限制性內切酶可以將RVD模塊分別生成不同的粘性末端,同時又不留有酶切位點,通過GoldenGate反應實現(xiàn)RVDs與TALEN骨架的無縫連接。
TALEN的蛋白質表達鑒定
TALEN構建成功后,將其質粒轉染大鼠細胞系后,提取總蛋白,進行SDS-PAGE電泳,利用標簽抗體進行western blotting檢測其表達。
TALEN的體外活性檢測
1)套峰檢測
TALEN質粒轉染大鼠細胞系,1~2天后提取細胞基因組DNA,PCR擴增靶位點序列,進行DNA測序,通過spacer區(qū)域出現(xiàn)套峰情況評價TALEN的活性。
2)錯配酶檢測
將靶序列PCR擴增子進行變性-退火,進行錯配酶(MSDase)反應,將MSDase的消化產物進行電泳,通過比較切割條帶與非切割條帶的比例,即可反映出TALEN的活性高低。
受精卵注射及基因敲除大鼠的基因型鑒定
利用體外轉錄試劑盒將有活性的TALEN分別體外轉錄為mRNA后進行受精卵注射。將打靶的胚胎移植到代孕母鼠的輸卵管,經過21-23天的孕育后F0代基因敲除大鼠出生,并進行基因型鑒定。