非洲豬瘟病毒檢測整體解決方案

1.常見樣本類型：
分泌物、血液、脾臟、扁桃體、腎臟和淋巴結(jié)等樣本中的非洲豬瘟。
 
 
2.. 樣品預(yù)處理方式（樣本處理區(qū)）
2.1 樣本前處理
2.1.1組織樣品：每份組織分別從 3 個(gè)不同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取
0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心2min，取上清液 200μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；
2.1.2全血樣本：取全血 200μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。
相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)備：動(dòng)物組織研磨儀、手持式電動(dòng)組織研磨儀

根據(jù)樣本數(shù)量多少可用高通量組織破碎儀或者手持式組織研磨儀破碎組織樣本，之后用離心機(jī)將樣本離心分層，取上清液。
2.2樣本保存和運(yùn)輸
上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。
 
2.3 DNA 提取
對(duì)上述處理好的標(biāo)本加入到預(yù)裝好提取試劑的96深孔板中，將加好樣本的耗材放置到96全自動(dòng)核酸提取儀中提取核酸。
 
96全自動(dòng)核酸提取儀用于病毒核酸的提取，配套提取試劑可以以散裝形式提供，也可以以預(yù)裝的形式提供，96高通量移液工作站可以用于散裝試劑的分裝。

 
3. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽性對(duì)照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，將上游引物、下游引物、熒光定量探針、酶液預(yù)混好，將混合好反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中。

試劑	用量
非洲豬瘟病毒熒光PCR引物探針Mix	1.6 uL
非洲豬瘟病毒熒光PCR Premix	10 uL
提取樣品ＤＮＡ	2 uL
RNase free H2O	6.4 uL
反應(yīng)總體積	20 uL

 
 

 
 
 
 
根據(jù)樣本的多少可以選用96高通量移液工作站或移液排槍進(jìn)行體系的配置和分裝。
 
4. 加樣（樣本處理區(qū)）
將提取的 DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取一定量，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

 
 
 
 
 
 
5. PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）
5.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；
5.2 設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 20μL；
熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。
5.3 相關(guān)設(shè)備：
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

 
 

• 若使用ABI 7300 PCR 儀，每個(gè)反應(yīng)需要加入0.4 uL的ROXⅠ（終濃度為1X）
• 若使用ABI 7500 PCR儀，每個(gè)反應(yīng)需要加入0.2 uL的ROX Ⅱ（終濃度為0.5X）

PCR 反應(yīng)循環(huán)條件設(shè)置

步驟	循環(huán)數(shù)	溫度	時(shí)間	熒光通道
1	1	95	0:30
2	40	95	0:10
		60	0:34	收集FAM熒光

 
 
6. 結(jié)果分析判定
6.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照)，重新分析結(jié)果。