基因數(shù)據(jù)分析的主流軟件

轉(zhuǎn)載自《生物技術(shù)世界》2005年6月版
在過去的幾年中，許多生物的基因組完成了測序工作，如何對如此龐大的原始序列信息進(jìn)行分析和應(yīng)用，正是現(xiàn)在最為棘手的問題。大量的基因預(yù)測軟件和在線工具應(yīng)運(yùn)而生。如何廣泛而深入地了解并能有的放矢地利用這些工具，已經(jīng)成為21世紀(jì)分子生物學(xué)家的必修課。

隨著大規(guī)模EST和cDNA序列信息的獲取，那些基于表達(dá)序列同源范圍的程序，在基因組注釋中的作用日益顯著。即使在稀少基因或組織特異性表達(dá)的基因中，基因組序列的相關(guān)性信息也頗具參考價值。所以利用基因組序列的比對來擴(kuò)充基因的信息是不可獲缺的。特別是在對人類基因組做注釋時，與那些相對完整的脊椎動物基因組，如小鼠和魚類的基因組比較是必不可少的步驟。許多基因組測序計劃正在進(jìn)行之中，盡管仍存在急需解決的問題，比較基因組學(xué)方法(comparative genome approach)被認(rèn)為是最有應(yīng)用前景的方法。該方法不僅在基因預(yù)測中舉足輕重，而且在鑒定調(diào)控基因、探索垃圾基因(junk gene)等方面的作用也不容忽視。基因預(yù)測軟件的用戶應(yīng)該認(rèn)識到，軟件預(yù)測結(jié)果的可靠性和置信水平都有較大程度的提升。但這些畢竟是預(yù)測的結(jié)果，分子生物學(xué)家，總是試圖證明真實(shí)存在的蛋白質(zhì)，及其功能和在組織中的表達(dá)狀態(tài)。

當(dāng)前，已有超過60種真核基因組測序計劃在進(jìn)程之中。然而生物學(xué)方面的相關(guān)注釋還遠(yuǎn)不能匹配如此洶涌而至的原始序列數(shù)據(jù)。當(dāng)務(wù)之急是，研發(fā)出更多的準(zhǔn)確而快速的分析工具，特別在尋找基因、確定其準(zhǔn)確功能等應(yīng)用方面。許多基因預(yù)測程序都可以免費(fèi)共享。http://linkage.rockefeller.edu/wli/gene/.列出了很多相關(guān)參考。當(dāng)前，幾乎沒有一個完美的程序可以解決用戶們的所有問題。這就需要用戶最大程度地利用主流程序的整合優(yōu)勢。

基因數(shù)目預(yù)測的主流軟件

十年前，研究人員開始預(yù)測人類基因的數(shù)目，這個數(shù)目在很長時間沒有明顯改變。幾年前，最多的預(yù)測是100,000；當(dāng)人類基因組完成測序時，這個數(shù)目降至30,000�，F(xiàn)在有降至20,000左右。研究人員相信：充分考慮人類的基因組序列和其它生物的基因組序列，可以做出近似的估計。Affymetrix 的計算科學(xué)家David Kulp稱：“很難對基因數(shù)目的諸多估算，做出正誤的判別。”分子生物學(xué)家正在尋找比預(yù)期設(shè)想的基因更小的基因。在某種情況下，就一段編碼的序列，很難確定是一個基因或是兩個基因的重疊。學(xué)術(shù)界仍不能完全肯定地歸類那些編碼多種蛋白質(zhì)的基因，或是僅編碼RNA的類似基因的序列。

早在20世紀(jì)30年代,George Beadle 和Tatum認(rèn)為每個基因僅僅編碼一個蛋白質(zhì)。幾十年來這個說法仍舊沿襲�，F(xiàn)在則認(rèn)為這樣的理論過于簡單。一個基因可以編譯成多種蛋白質(zhì)，甚至可以轉(zhuǎn)錄成RNA。人類基因組中編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域，稱為外顯子，約僅占總體DNA的2%。一些簡單的基因僅含有一個外顯子。有些基因沒有功能，稱為假基因pseudogene：是與已知基因在不同部位有密切相似性的基因，但由于結(jié)構(gòu)上有加入或缺失，而阻止了正常的轉(zhuǎn)錄或翻譯，以致使它們無功能。這樣就會增加基因預(yù)測的數(shù)量，造成許多假陽性的結(jié)果。英國劍橋的EBI(European Bioinformatics Institute)的基因預(yù)測專家Ewan Birney指出：“目前預(yù)測的人類24,500個基因中，有將近3,000個基因可能為pseudogene”。華盛頓大學(xué)的計算科學(xué)家Michael Brent稱：“如果在基因預(yù)測中準(zhǔn)確地考慮到假基因的存在，那么預(yù)測的結(jié)果會更為精確。”

目前廣泛應(yīng)用的基因預(yù)測方法是：“ab initio”方法，即通過探索DNA序列中特異的區(qū)域，如基因的起始區(qū)域和終止區(qū)域，來進(jìn)行基因預(yù)測。另一種方法是比較基因組學(xué)的方法，即根據(jù)與已知的蛋白質(zhì)或基因之間的相似性來發(fā)現(xiàn)新的基因。Ab initio程序?qū)τ谀切╊愃朴诨�因的序列，也給予歸類，所以總的預(yù)測數(shù)量要高出實(shí)際值；而比較的方法不考慮無相似關(guān)系的基因，所以估計的基因數(shù)目偏低。大多數(shù)人所熟知的一個ab initio程序叫做Gene Modeler是1990年新墨西哥洲大學(xué)的Chris Fields和Cari Soderlund研發(fā)的。當(dāng)時是被應(yīng)用在線蟲Caenorhabditis elegans的基因探尋過程中。那時出現(xiàn)的其它軟件都稍遜于Gene Modeler。例如，BLAST、FASTA能將DNA序列翻譯成蛋白質(zhì)序列，并與已有的、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

這個領(lǐng)域進(jìn)展迅速，涌現(xiàn)出許多具有專業(yè)軟件編寫技能的預(yù)測人員，包括采用Gene Modeler的方法創(chuàng)建GeneID來尋找人類基因的Guigo。以及，編寫GeneParser軟件的Eric Snyder。GeneParser采用了一個稱為動力學(xué)程序的技術(shù)，將外顯子與不編碼蛋白質(zhì)的內(nèi)含子區(qū)分開來。Rockville的TIGR（The Institute for Genomic Research）的Steven Salzberg自從1994年，利用ab initio的方法，來改進(jìn)尋找人類基因的程序。隨后的幾年里，他們又研發(fā)出幾個新的程序。其中的一個是與更為詳盡的背景信息相整合，進(jìn)行基因預(yù)測。它可以更加清楚地預(yù)測外顯子和內(nèi)含子的大小。另一個程序是同時作用于兩個完整的基因組，由計算機(jī)完成兩者的比較。許多研究人員更傾向于后種方法，原因是相似的物種，更為傾向于擁有相似的基因序列。National Human Genome Research Institute的遺傳學(xué)家Eric Green說，他及他的同事，已經(jīng)從13個物種中進(jìn)行了DNA比較，包括狗、牛、雞以及河豚魚。2003年8月14日的Nature上發(fā)表了他們對基因、以及調(diào)控區(qū)域的比較結(jié)果。

GENSCAN就是一個經(jīng)典的基因預(yù)測軟件。1996年由MIT的Chris Burge開始編寫這個軟件程序。當(dāng)時，Burge的許多同事主張采用比較的方法，他們隨機(jī)選取一個最新測序基因組中基因的DNA序列，與數(shù)據(jù)庫中已存在的基因進(jìn)行聯(lián)配。但是Chris Burge認(rèn)為：“利用人類基因組所獲知的信息，可能不能發(fā)現(xiàn)某些新的基因。” 他還積極吸取了加州大學(xué)計算機(jī)科學(xué)家David Haussler的經(jīng)驗。很多年前，Haussler就意識到基因預(yù)測的問題與語言學(xué)家們所遇到的問題相類似。語言學(xué)家總是試圖尋找語言中句法、語法，以及其它某些特征。Haussler和其他人都建議從語言學(xué)中借助一種叫做Hidden Markov Model, HMM隱馬爾科夫模型的統(tǒng)計工具。在序列分析中，HMM通常是多重序列對位排列的概率模型，但也可用于單一序列的周期性模式的模型，比如代表發(fā)現(xiàn)基因外顯子的模式。在一個多重序列對位排列的模型中，用被稱作狀態(tài)的符號的概率分布代表排列中的每一列字母，插入和缺失用其他狀態(tài)表示。然后在模型內(nèi)沿特定的路徑從一個狀態(tài)進(jìn)入另一個狀態(tài)，試圖匹配一條給定的序列。從每一狀態(tài)選出下一個匹配符號，記錄其概率（頻率）和從前一狀態(tài)進(jìn)入特定狀態(tài)的概率（過渡態(tài)概率）。狀態(tài)與過渡態(tài)的概率相乘就得到給定序列的概率。一般來說，HMM是一個對給定字符的統(tǒng)計模型，類似隨機(jī)狀態(tài)機(jī)器，從每一個狀態(tài)過渡到另一個就產(chǎn)生一個字符。狀態(tài)間的過渡態(tài)用過渡概率確定。HMM已成為許多基因預(yù)測算法的標(biāo)準(zhǔn)。Burge指出：目前存在一整套的能夠區(qū)分部分基因的模式和規(guī)則。比如，幾乎所有的基因在起始和終止區(qū)域存在特異的序列。外顯子的末端通常也存在一個特征序列，可以指導(dǎo)相關(guān)的酶切除外顯子下游的內(nèi)含子。Burge已經(jīng)利用這些規(guī)則分析了幾百個已知外顯子和內(nèi)含子位置的基因序列。

GENSCAN是進(jìn)行基因預(yù)測的首選工具。但是，即使最好的預(yù)測軟件也存在不足之處。GENSCAN就過分估算了基因數(shù)目。它的預(yù)測結(jié)果是人類基因組中有45,000個基因，相當(dāng)于現(xiàn)在普遍認(rèn)可數(shù)目的兩倍。Burge承認(rèn)GENSCAN確實(shí)存在問題，但他認(rèn)為太多的基因總比太少要好。對于過剩的預(yù)測，用戶可以積極去除假陽性的結(jié)果。Burge稱：GENSCAN可能不能預(yù)測基因的準(zhǔn)確數(shù)目，但從人類和其它物種的基因數(shù)據(jù)分析中所得到的新的序列，可以進(jìn)一步完善GENSCAN。他還指出，如果能繼續(xù)開展基因的探尋工作，他會更傾向于選用比較學(xué)的方法。

其他程序，如GeneSweep、Ensembl/Genewise，則是基于對數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝來尋找基因。但是它們比早期的比較學(xué)方法更為成熟。Genewise是Birney和他的同事，從已知的蛋白質(zhì)序列著手進(jìn)行基因分析的程序。這些蛋白質(zhì)都來自已知氨基酸序列的蛋白質(zhì)家族，具有保守的DNA序列。蛋白質(zhì)或多或少的相類似。利用這些蛋白質(zhì)家族組裝起來所形成的優(yōu)勢，計算機(jī)就能比較來自同種或不同個體已知的蛋白質(zhì)序列和新的蛋白質(zhì)序列。隨著更多的物種基因組被測序，比較整個基因組，而不是比較那些相對短小的序列，正逐漸變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。Affymetrix公司的Kulp稱：現(xiàn)在整合這些比較的方法來預(yù)測基因，已經(jīng)成為最具應(yīng)用前景的研究路線。并且眾多的應(yīng)用程序都融合了多元策略進(jìn)行基因預(yù)測。

Gene Counts

表一：主流軟件對人類基因數(shù)目預(yù)測

基因序列分析的主流軟件

在一定的精度范圍內(nèi)，利用生物信息學(xué)的方法和軟件對目標(biāo)基因的基本特征進(jìn)行分析，能夠讓分子生物學(xué)家更為迅速和全面地發(fā)現(xiàn)基因的特征，了解基因在生命體中的真實(shí)結(jié)構(gòu)和功能，從而為大規(guī)模地開展基因的后續(xù)分析奠定基石。

核苷酸序列中蘊(yùn)涵著豐富的信息，對于編碼基因序列的分析，主要是圍繞如下內(nèi)容進(jìn)行：尋找開放讀碼框、預(yù)測基因功能、分析選擇性剪切方式、分析基因多態(tài)性位點(diǎn)、分析基因表達(dá)調(diào)控區(qū)域、統(tǒng)計序列GC含量、追蹤密碼子使用偏向性、設(shè)計應(yīng)用于目的基因的酶切位點(diǎn)和引物等，

尋找基因的開放讀碼框：基因的開放讀碼框（Open Reading Frame），包含從5’端翻譯起始密碼子(ATG)到終止密碼子（TAA、TAG、TGA）之間的一段編碼蛋白質(zhì)的堿基序列。開放閱讀框的預(yù)測程序主要是針對編碼區(qū)的特征進(jìn)行統(tǒng)計、以及相關(guān)模式的識別或是利用同源比對的識別方法�，F(xiàn)在較為主流的程序是GetOrf、ORFFinder、Plotorf，就是專門識別ORF的有利工具。一些功能強(qiáng)大的軟件如：GENSCAN、GRAIL = 2 \* ROMAN II、GENEMARK、GlimmerM除進(jìn)行ORF的分子外，還可對多種基因的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析。專業(yè)人員常用的軟件還有：Genefinder、Genehunter、FGeneSH、FGeneSB、FGeneSV、Generation、BCM Gene Finder、Genebuilder等。其中GlimmerM和FGeneSB更適與原核生物的基因預(yù)測。

外顯子和內(nèi)含子剪切位點(diǎn)的分析：在真核生物中基因的外顯子和內(nèi)含子長度不一，但剪切供體和受體的位點(diǎn)具有相當(dāng)程度的保守性。所謂的供體位點(diǎn)(donor)是基因內(nèi)含子5’
端GU的位置；受體位點(diǎn)(acceptor)是內(nèi)含子3’端AG的位置。對于mRNA或cDNA序列的分析是通過比對相關(guān)的基因組序列，來進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。例如，Spidey（是NCBI開發(fā)的工具軟件），Sim4，BLAST等程序。NetGene2和Splice View可以提供編碼區(qū)核苷酸序列剪切位點(diǎn)的直接預(yù)測。

分析基因的選擇性剪切：基因的選擇性剪切機(jī)制(Alternative splicing)：真核基因轉(zhuǎn)錄成前體mRNA后，還要進(jìn)一步改裝成成熟的mRNA。許多基因并不是一次全部切除其內(nèi)含子，而是在不同的細(xì)胞、或不同的發(fā)育階段，選擇性地剪切其內(nèi)含子，從而生成不同的mRNA。隨著數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)信息的指數(shù)增加，目前運(yùn)用生物信息學(xué)的工具對基因產(chǎn)物的選擇性剪切，也能開展較為詳盡的分析。眾多的選擇性剪切機(jī)制數(shù)據(jù)庫，可利用http://scholar.google.com/進(jìn)行在線搜索。較為流行的如：ProSplicer就是基于蛋白質(zhì)、mRNA、EST序列的選擇性剪切數(shù)據(jù)庫。

分析基因的表達(dá)調(diào)控區(qū)域：基因組中全部基因的表達(dá)，都遵循嚴(yán)整而精確的調(diào)控機(jī)制�；�因的調(diào)控區(qū)域序列相關(guān)特征的深入分析，為全面了解基因的功能提供豐富的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。 = 1 \* GB2 ⑴脊椎動物的5’
端的啟動子周圍是CpG島，它是尋找基因的重要線索。EMBL提供的CpG島的計算工具是：CpGPlot/CpGReport/Isochore。CpG Island和CpG promoter也是較為常用的工具。 = 2 \* GB2 ⑵對基因的核心啟動子、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的識別：可充分利用TRRD、TransFac、MIRAGE、EPD等在線基因調(diào)控區(qū)域的數(shù)據(jù)庫；Softberry軟件集團(tuán)http://www.softberry.com/
推出的：BPROM、TSSP、TSSG、TSSW等軟件也值得使用。 = 3 \* GB2 ⑶預(yù)測轉(zhuǎn)錄終止的信息：使用的工具是Hcpolya。 = 4 \* GB2 ⑷分析密碼子的使用偏性：有DOS運(yùn)行界面的CodenW、SYCO、CHIP、Codon usage。 = 5 \* GB2 ⑸分析限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)：WEB Cutter、CUTTER、TACG interface、Watcut、NEB cutter、Digest等。

核苷酸序列綜合分析軟件：用戶通常需要對目的基因進(jìn)行多重分析，所以將序列拼接、基因序列的組分分析、編碼區(qū)域預(yù)測、序列比對、引物設(shè)計、酶切位點(diǎn)預(yù)測等多項獨(dú)立的分析加以整合的綜合分析軟件應(yīng)運(yùn)而生。目前有GeneBuilder、DNA Tool、SEQ tools、DNAssist、GeneTool、DNAman、DNA Strider、p DRAW32、gene-explorer等。GeneBuiler就是多模塊單獨(dú)執(zhí)行功能的基因結(jié)構(gòu)預(yù)測系統(tǒng)(Gene Structure Prediction System)。

新數(shù)據(jù)的獲得驅(qū)動著軟件的研發(fā)。目前現(xiàn)有的海量數(shù)據(jù)庫，它們的質(zhì)量和特征差異懸殊，仍需進(jìn)行繼續(xù)完善。London-based online的出版商BioMed Central的數(shù)據(jù)編輯Matthew Day稱：“目前還沒有較為理想的公共數(shù)據(jù)庫集合群，服務(wù)于所有不同研究領(lǐng)域生物學(xué)工作者。所有的數(shù)據(jù)都應(yīng)具備友好的用戶界面，并與期刊數(shù)據(jù)庫相鏈接。那時每個生物學(xué)者都可以暢快淋漓地享受數(shù)據(jù)汪洋的航行。

在基因組時代，那些小的實(shí)驗室很容易感到滯后性。相比之下，規(guī)模較大的生物技術(shù)公司，現(xiàn)在僅在一個下午完成的工作，對于中型的實(shí)驗室可能要耗費(fèi)數(shù)月之久。但是生物信息軟件技術(shù)將專業(yè)的數(shù)據(jù)分析知識和技術(shù)，全部壓縮到密集的程序集中。事實(shí)證明，這些軟件的應(yīng)用前景將更加廣泛，操作界面也日趨簡化，運(yùn)行的結(jié)果更易于注釋。嶄新的在線服務(wù)和軟件產(chǎn)品，讓枯燥無味的數(shù)據(jù)分析變得妙趣橫生。