生物芯片技術在藥物R&D中的應用
1946年世界上第一臺電子數字計算機ENIAC在美國Pennsylvania大學問。在隨后的50年里，以美國的硅谷為搖籃，計算機技術不斷飛速發(fā)展，給我們的生活帶來了巨大的變革。無獨有偶，1991年又是在美國硅谷，Affymax公司開始了生物芯片的研制，他們將芯片光刻技術與光化學合成技術相結合制作了寡核苷酸陣列芯片。近年來，以DNA芯片為代表的生物芯片技術，得到了迅猛發(fā)展，已有多種不同功能的生物芯片問世。目前生物芯片技術已應用于分子生物學、疾病的預防、診斷和治療、新藥開發(fā)、生物武器的研制、司法鑒定、環(huán)境污染監(jiān)測和食品衛(wèi)生監(jiān)督等諸多領域，已成為各國學術界和工業(yè)界所矚目并研究的一個熱點。
生物芯片的概念源自于計算機芯片，狹義的生物芯片即微陣列芯片，主要包括cDNA微陣列、寡核苷酸微陣列、蛋白質微陣列和小分子化合物微陣列。分析的基本單位是在一定尺寸的基片（如硅片、玻璃、塑料等）表面以點陣方式固定的一系列可尋址的識別分子，點陣中每一個點都可以視為一個傳感器的探頭。芯片表面固定的分子在一定的條件下與被檢測物進行反應，其結果利用化學熒光法、酶標法。同位素法或電化學法顯示，再用掃描儀等儀器記錄，最后通過專門的計算機軟件進行分析。廣義的生物芯片是指能對生物成分或生物分子進行快速并行處理和分析的厘米見方的固體薄型器件，其主要種類有微陣列芯片、過濾分離芯片、介電電泳分離芯片、生化反應芯片和毛細管電泳芯片等。
隨著21世紀的到來，制藥公司正面臨著一次嚴峻的市場挑戰(zhàn)。這些公司為了保持或增強在市場上的競爭力，不得不尋求發(fā)展新的藥物開發(fā)技術以提高藥物發(fā)現的速度，縮短新藥上市的時間，減少藥物開發(fā)的成本。近年來生物芯片技術的飛速發(fā)展，引起了制藥業(yè)的極大興趣，使得生物芯片技術在藥物研究與開發(fā)領域得到越來越廣泛的應用，已逐漸滲入到藥物研發(fā)過程中的各個步驟。本文將主要討論生物芯片技術在藥物靶點發(fā)現與藥物作用機制研究、超高通量藥物篩選、毒理學研究、藥物基因組學研究以及藥物分析中的應用。
1 生物芯片在藥物靶點發(fā)現與藥物作用機制研究中的應用
藥物靶點發(fā)現與藥物作用機制研究是生物芯片技術在藥物研發(fā)中應用最為廣泛的一個領域。在藥物靶點發(fā)現和藥物作用機制研究中所使用的生物芯片主要是指DNA芯片。在DNA芯片的表面，以微陣列的方式固定有寡核苷酸或cDNA。使用DNA 芯片可以對研究者感興趣的基因或生物體整個基因組的基因表達進行測定。在當代藥物開發(fā)過程中發(fā)現和選擇合適的藥物靶點是藥物開發(fā)的第一步，也是藥物篩選及藥物定向合成的關鍵因素之一。人體是一個復雜的網絡系統(tǒng)，疾病的發(fā)生和發(fā)展必然牽涉到網絡中的諸多環(huán)節(jié)。當今嚴重威脅人類健康的心腦血管疾病、惡性腫瘤、老年性癡呆癥和一些代謝紊亂疾病都是多因素作用的結果，往往不能歸結于單一因素的變化。應用一些基因尋找策略如DD PCR等雖然為發(fā)現新的功能基因提供了一些線索，但還是有相當的局限性。而DNA芯片可以從疾病及藥物2個角度對生物體的多個參量同時進行研究以發(fā)掘藥物靶點并同時獲取大量其他相關信息。因此可以說，在這種情況下，任何一元化的分析方法均不及 DNA芯片這種集成化的分析手段更具有優(yōu)勢。
DNA芯片在藥物靶點發(fā)現與藥物作用機制研究中的應用具體表現在以下幾個方面。
1 比較正常不同組織細胞中基因的表達模式:
基因的表達模式給它的功能提供了間接的信息。例如只在腎臟中表達的基因就不大可能與精神分裂癥有關。一些藥物的靶點是在整個身體中分布廣泛的蛋白質，這類藥物的不良反應往往比較大。而選擇只在特異組織中才表達的蛋白作為藥物篩選的靶點，可以減少藥物對整體產生的不良反應，因而更引起人們的關注。例如骨質疏松癥（osteoporosis）與破骨細胞（osteoclasts）的功能有關，破骨細胞可以破壞并吸收骨質，當骨質的形成與破壞出現不平衡的時候，就會導致骨質疏松癥。如果破骨細胞的功能得到抑制，那么就可以控制骨質疏松癥的發(fā)生和發(fā)展。利用已有的人類EST序列和DNA芯片技術，可以容易地得到只在破骨細胞中進行表達的基因如 cathepsink基因，它編碼半胱氨酸蛋白酶。以 cathepsink基因作為靶標，篩選對它有抑制作用的藥物，就有可能得到治療骨質疏松癥的藥物。但是這種方法也有其局限性，它只能得到mRNA水平的表達譜，另外組織一般由多種細胞組成，而要將這些細胞分離很困難。
2 研究正常組織與病理組織基因表達差異
正常組織在病變的過程中，往往伴隨著基因表達模式的變化�；虮磉_水平的升高或降低，可能是病變的原因，也可能是病變的結果。若基因表達的變化是病變的原因，則以此基因為靶點的藥物就可能逆轉病變；若基因表達的變化是病變的結果，則以此基因為靶點的藥物就可能減輕病變的癥狀。DNA芯片技術可以在病理組織與正常組織之間一次比較成千上萬個基因的表達變化，找出病理組織中表達異常的基因。Heller等提取正常及誘發(fā)病變的巨噬細胞、軟骨細胞系、原代軟骨細胞和滑膜細胞的 mRNA，用包含細胞因子、趨化因子、DNA結合蛋白及基質降解金屬蛋白酶等幾大類基因的cDNA芯片進行篩選，發(fā)現了數種變化明顯的基因。其中除了有已知與類風濕關節(jié)炎有關的TNF，IL－1，IL－6，IL－ 8，G－CSF，RANTES，VCAM的基因外，還有編碼基質金屬彈性蛋白酶HME，IL-3，ICE，趨化因子Groα 等的基因。而以前認為金屬彈性蛋白酶只存在于肺泡巨噬細胞和胎盤細胞中。彈性蛋白酶可以破壞膠原纖維及組織基底膜層，它在類風濕關節(jié)炎病理組織中的出現，為治療該病提供了新的藥物靶點。
利用DNA芯片來尋找疾病相關基因的策略尤其適用于病因復雜的情況。例如，惡性腫瘤的發(fā)生常常是多基因共同作用的結果，DNA芯片技術在腫瘤細胞基因表達模式及腫瘤相關基因發(fā)掘中具有重要的作用。Wang等將一些看家基因、細胞因子及受體基因、細胞分裂相關基因及其他一些癌基因共5766個基因的cDNA探針固定在芯片上，對正常卵巢組織及卵巢癌組織的mRNA進行分析，發(fā)現二者之間30％基因表達相差2倍以上，9％相差3倍以上，其中上調較為明顯的有CD9．上皮糖蛋白（ep ithelial glycoprotein）、p27及HE蛋白激酶抑制物等。這些結果不僅進一步證實了以前用其他方法獲得的結果，還提供了一些新的信息。再如，Kapp 等用包含950個DNA探針的DNA芯片分析比較霍奇金病細胞系L428及KMH2與EB病毒永生化的B淋巴細胞系LGL－GK的基因表達港，發(fā)現霍奇金病源的細胞系中白細胞介素-13（IL－13）及白細胞介素-5（IL－5）表達異常增高；用IL－13抗體處理霍奇金病源的細胞系可顯著抑制其增殖。此發(fā)現提示，IL-13可能以自分泌形式促進霍奇金病相關細胞增殖。IL-13及其信號轉導途徑可能成為霍奇金病治療及藥物篩選的新靶點。
3 建立模式生物細胞中的基因表達模型
采用模式生物細胞進行試驗，條件容易控制，對模式生物基因表達的研究將啟發(fā)人們發(fā)現和確認新的藥物作用靶點。目前，已有多種模式生物（如酵母）的基因組計劃已經完成。釀酒酵母（saccharomvces cerevisi ae）就是一種可用來進行藥物篩選的較為理想的模式生物。它是真核生物而且基因組已全部測序，細胞繁殖快，易于培養(yǎng)，與哺乳動物細胞有許多共同的生化機制�，F在已經發(fā)現，在酵母細胞中存在許多與人類疾病相關的基因。如人類Werner''''s綜合征表現出早熟的特征，其細胞的生活周期變短。人類與此疾病相關的基因與酵母中編碼DNA解旋酶的 SGS1基因極為相似。Botstein等得到了SGS1基因突變的酵母菌株，此突變菌株生活周期變短，細胞的表型特征與患有Werner''''s綜合征入細胞相似。已有一些研究小組根據公布的酵母基因組序列，用PCR方法擴增了酵母6000多個開放閱讀框（open reading frame，ORF）片段，制成DNA芯片，在整個基因組的范圍內對酵母的基因表達進行檢測。
4 建立病原作基因的表達模型
由于病原體的基因組規(guī)模相對較小，可用包含其全部基因的DNA 芯片鑒定那些對人產生毒害作用的基因。異煙肼（isoniazid，INH）是治療肺結核的常用藥物，其治療結核病的機制是它阻斷了分枝茵酸的生物合成途徑。Wilson等根據已測序的肺結核桿菌基因組序列，用PCR方法擴增了3834個ORF（占全部 ORF的97％），固化在玻片上，制成檢測肺結核桿菌基因表達的DNA芯片。用INH處理敏感菌株，發(fā)現除了生化途徑已清楚的與分枝菌酸合成相關的一些基因轉錄水平發(fā)生變化外，還發(fā)現EfpA基因的表達也被誘導發(fā)生了變化，推測EfpA基因也參與了分枝菌酸的生物合成，而EfpA基因只在分枝菌屬中一些致病的種類中才存在，故EfpA基因可以作為治療結核病的新靶點。另外，分別用INH和 Ethionamide處理敏感菌株，獲得了相似的基因表達譜，證實了兩者具有相同的作用機制。
5 研究藥物處理細胞后基因未達變化
藥物與細胞（特別是敏感細胞）相互作用，將引起細胞外部形態(tài)及內部正常代謝過程的一系列變化。其內部生理活動的變化可集中表現在其基因表達的變化上。通過測定分析藥物對細胞的基因表達的影響，可推測藥物的作用機制，評價藥物活性及毒性，進而確證藥物靶點或者發(fā)現新的藥物靶點。通過DNA芯片測定藥物誘導的細胞基因表達變化來進行藥物篩選與研究，對那些用常規(guī)方法很難追蹤監(jiān)測的藥物或需要很長時間才能得到藥物臨床實驗結果時，顯得尤為有用。
通過監(jiān)測陽性藥物處理前后組織細胞基因表達變化情況可以獲得許多十分有價值的信息。首先，經藥物處理后表達明顯改變的基因往往與發(fā)病過程及藥物作用途徑密切相關，很可能是藥物作用的靶點或繼發(fā)事件，可作為進一步藥物篩選的靶點或對已有的靶點進行驗證；其次，藥物處理后基因表達的改變對藥物作用機制研究有一定的提示作用。
理論上講，藥物作用誘導的細胞基因表達變化應與缺失編碼該藥物作用靶點的基因引起的基因表達變化相似。Marton等使用含有6065個釀酒酵母的ORF的DNA芯片檢測發(fā)現，由免疫抑制劑 FK506誘導的的基因表達變化在缺失編碼被 FK506抑制的蛋白的基因變種中未觀察到，但在缺失與FK506作用無關的基因變種中卻視察到了。于是推測FK506除了與親免蛋白（immunophilins）結合外還有其他被忽略的作用靶（off－target）。在實驗基礎上，他們提出了所謂的解碼器戰(zhàn)略（decoder strategy），即首先比較經過藥物作用的野生株和缺失某些基因的變種株的基因表達譜，若二者相似，則將這種變種挑選出來，并將其與藥物作用。如果突變基因所編碼的蛋白質參與的生物途徑受藥物的影響，則藥物誘導該變種的基因表達變化與藥物誘導野生株基因表達變化將不同。用這種策略不僅可以確證藥物作用靶，還可以發(fā)現未曾引起人們注意的作用靶，并可從這些被忽略掉的靶中推測藥物的毒副作用。Cyclin依賴型激酶（cyclin－dependent kinas es，CDKs）在細胞增殖中有著重要的作用，是一種抗腫瘤藥物的靶點。Gray等從2，6，9，-三取代嘌呤化合物庫中篩選CDKs的抑制劑。他們將體外有活性的2種化合物flavopiridol和52（化合物代號）與酵母作用，然后用共含有260000個長度為25個堿基的一組寡聚核苷酸芯片檢測酵母基因表達變化。試驗結果表明，幾乎所有的已知與細胞周期相關的基因表達下調。雖然flavopiridol和52體外活性相似，但他們引起的酵母基因表達的變化卻有顯著的差異，表明二者對酵母的作用途徑是不一樣的。
鬼臼亞乙苷（etoposide）是p53活化拓撲異構酶 Ⅱ的抑制劑，在臨床上作為一種抗腫瘤藥物。Wang 等經用鬼臼亞已苷作用人成骨肉瘤細胞系U2－ OS后，根據不同的時間間隔分別提取細胞mRNA，用寡核苷酸芯片測定6591條mRNA表達百的變化，發(fā)現62條mRNA表達縣有變化。通過選取其中12條基因做進一步研究，發(fā)現有2條是已知的 p53調控基因（WAF1／p21和PCNA），有兩條是新的p53靶基因，其余的與p53無關。在實驗基礎上，他們提出了介導鬼臼亞乙苷誘導細胞凋亡的信號傳導途徑。此項研究工作使人們又多獲得一種抗腫痛藥物的靶點。
應用DNA芯片還可直接篩選特定的基因文庫以尋找藥物的作用靶點。如給酵母某一特定的呈單倍體狀態(tài)的基因對應的位置上放置一個遺傳標記，該標記可被DNA芯片所識別，那么通過比較藥物作用前后用芯片檢測整個文庫的結果，便有可能獲得藥物作用的靶基因。研究者稱此種篩選方式為 haploinsufficiency drug screen。
用DNA微陣列芯片進行藥物研究還存在如下一些缺點：①由于雜交樣品制備復雜，采用DNA微陣列芯片很難實現高通量。②DNA微陣列芯片只能用于檢測已知序列的基因。③由于靈敏度的限制，采用現存的DNA微陣列芯片難以檢測到表達水平很低的基因。
除了DNA芯片外，組織芯片、蛋白質芯片和細胞芯片也在藥物研究中嶄露頭角。最近，耶魯大學的研究小組首次報道了真核生物蛋白質組水平的蛋白質微陣列芯片。他們表達和純化了酵母的 5800種蛋白質，并將這些蛋白質點樣固定在載玻片上，制作了酵母蛋白質組微陣列芯片。他們使用這種芯片篩選能與特定蛋白質和磷脂相互作用蛋白質，發(fā)現了新的能與鈣調蛋白和磷脂相互作用的蛋白質。這種蛋白質微陣列芯片可以用于篩選與蛋白質相互作用的藥物，還可以用于檢測蛋白質翻譯后的修飾。他們的研究成果證實了制作和使用蛋白質組微陣列芯片進行功能分析檢測的可行性，并向人們預示了蛋白質微陣列芯片在藥物開發(fā)領域的廣闊應用前景。
Zlauddin和Sabatinl發(fā)明了一種細胞微陣列芯片。他們首先將不同的質粒DNA點在玻璃片上，做成質粒DNA做陣列芯片。接著用脂質轉染試劑處理該質粒DNA微陣列芯片，然后在處理好的質粒DNA微陣列上培養(yǎng)哺乳動物細胞。點在芯片上的質粒DNA在轉染試劑的幫助下原位轉染哺乳動物細胞，在質粒DNA微陣列的每一個質粒樣品點的相同位置形成了轉染了該質粒的細胞群。細胞因獲得了外源DNA而獲得了新的性狀。這樣，由質粒DNA芯片制成了由不同性狀細胞組成的細胞做陣列芯片。他們嘗試用這種細胞芯片來確證藥物作用靶點，尋找能改變細胞生理狀態(tài)的基因產物。這種新型細胞芯片可以用來在哺乳動物細胞內高通量篩選有可能成為候選先導分子的化合物、蛋白質或寡核苷酸。在功能基因組研究和藥物開發(fā)等領域具有很大的應用潛力。
2 生物芯片作為超高通量篩選平臺的應用
在過去的十幾年里，隨著科學的進步以及在巨大的經濟利益驅使下，藥物篩選技術得到了飛速的發(fā)展。在80年代中期（高通量篩選形成之初），每天只能篩選30種化合物，到90年代中期，每天可篩選1，500種化合物，而如今每天可篩選超過 100，000個化合物。高速、低成本的高通量篩選已成為當今藥物篩選的主流，并逐漸向超高通量方向發(fā)展。在過去的幾年中，世界上著名的制藥公司紛紛與以高通量藥物篩選技術為核心的中小型生物科技公司結盟或合作，采用高通量或超高通量藥物篩選技術進行先導物分子的篩選。要進一步提高篩選率，高通量篩選技術的各個方面均需要技術創(chuàng)新，這為生物芯片技術進入藥物篩選領域提供了寶貴的契機。
提高藥物篩選的通量，實現超高通量篩選有2 條途徑：一是微型化，一是自動化。生物芯片作為一種新型技術平臺，正可滿足超高通量篩選微型化和自動化的需要。生物芯片技術應用于超高通量篩選有2個發(fā)展方向：一是微孔板/微陣列技術，一是微流體芯片技術。
微孔板/微陳列技術
微孔板技術的發(fā)展主要表現在板孔數的增加。目前，使用最多的是96孔及384孔板，也有人使用1536孔、3456孔、甚至 9600孔板。如Oldenburg等報道了用9600孔板（0.2μL/孔）分析系統(tǒng)，以金屬蛋白酶為靶，對組合及分離純化的化合物庫進行篩選的結果。雖然隨著材料科學和加工技術的發(fā)展，微孔板技術有了長足的進步，但其發(fā)展面臨著一些不易解決的困難，主要有：微量液體極易蒸發(fā)，不適于那些不能用二甲亞砜（DMSO）作溶劑的篩選方法以及受限于當今還不夠完善的微量液體分配技術。
微陣列技術是將微孔板技術進一步微型化。最近，哈佛大學的研究人員開發(fā)了化合物微陣列芯片，主要用于篩選能與特定蛋白質特異性結合的化合物。他們將玻片表面進行化學處理，使其衍生化產生活性基團，然后將溶于有機溶劑中的化合物用機械手點在經處理的玻片表面，化合物與玻片表面的活性基團反應而被固定于玻片表面，這樣就將不同的化合物排布成微陣列，固定在玻片表面，制成化合物微陣列芯片。隨后將感興趣的蛋白質進行熒光標記，然后與微陣列芯片上的化合物反應，經清洗后，再進行熒光檢測就可以篩到能與這種蛋白質特異性結合的化合物。他們用化合物微陣列芯片進行了原理性實驗，其結果表明，使用這種化合物微陣列芯片可以并行、快速地進行大規(guī)模的化合物與蛋白質的結合篩選。他們最先是將玻璃片表面進行馬來酰亞胺衍生化處理，后來采用亞硫酰氯處理，都獲得了成功。他們還嘗試了使用這種化合物微陣列芯片進行大規(guī)模對映異構體的分型檢測。加利福尼亞大學Davis分校的科學家們采用類似的方法也制造了一種化合物微陣列芯片。他們對玻琥載玻片表面進行氨基化處理，在氨基玻片上進行乙醛酰衍生化，然后將帶有連接臂的配體分子點在修飾過的玻片表面。在進行化學連接反應之后，這種固定了不同小分子配體的微陣列芯片被用來進行了3種生物學檢測：蛋白質結合檢測、功能磷酸化檢測和活細胞粘附檢測。實驗結果證實了化合物微陣列芯片可以幫助我們對由組合合成方法獲得的大量化合物進行快速的功能分析和篩選。化合物微陣列芯片技術與基于微珠體的固相組合會成技術相結合為高通量藥物篩選帶來了一條新的途徑，將對高通量藥物篩選技術的發(fā)展產生積極的影響。
最近，出現了一種被稱為芯片膜片鉗（patch-on- a－chip）的新技術。在這種膜片鉗芯片上加工有檢測電信號的點陣，點陣中的每一個點是一個電信號記錄單元，同時每個點底部與負歷相通，可以吸位細胞。這樣膜片鉗芯片上的每一個點就可以實現傳統(tǒng)膜片鉗技術的功能。膜片鉗芯片具有操作簡單、快速和可實現高通量等優(yōu)點，可以用于電生理研究和高通量藥物篩選。位于美國圣地亞哥的AVIVA公司正在致力于此項技術的開發(fā)。
微流體芯片技術
微流體裝置的發(fā)展已廣泛用于生化及細胞的分析。鑒于這項技術在超高通量篩選中的巨大應用前景，吸引了眾多學術界和工業(yè)界的實驗室對該項技術的研究與開發(fā)。借用半導體工業(yè)中所用的光刻技術將內徑在10～100μm的做通道加工在玻璃或硅片中，利用電動泵和流體的壓力來控制皮、納升級液體的流動。該技術可減少幾個數量級的試劑消耗量，并能提高數據質量。它所采用的并行樣品處理程序可以獲得更高的篩選通量。多種類型的篩選分析方法在微流體芯片上操作的可行性（包括結合分析、酶分析和細胞分析）已得到實驗論證。
Jiang等制造了2種可以用于高通量檢測食物污染物和進行藥物篩選的微流體裝置。他們以硅為模板，采用模壓和毛細管成形技術在聚酯和多聚硅氧烷二甲酯中加工激流體網絡。在第1種裝置的微通道中夾著一塊PVDF（polyvinylidene fluoride）膜可用來結合、濃縮目標化合物，然后再直接通過質譜方法鑒定目標化合物。第2種裝置被用來超濾分離本巴比妥和苯巴比妥與抗體的復合物。整個過程包括上樣、清洗和解離都是連續(xù)進行的。這些微流體裝置不僅可以顯著降低系統(tǒng)死體積和所需樣品量，而且與先前報道的方法相比靈敏度至少可提高 1～2個數量級。
Capliper Technologies公司設計的芯片裝置，將從微孔板中取樣與隨后進行的酶抑制劑篩選結合在一起。目前，該芯片裝置已制作完成，并通過了測試。測試的化合物通過與芯片相連的硅毛細管注射入芯片中，與酶及熒光酶底物混合以使它們在主反應通道內發(fā)生相互作用。酶與熒光底物反應產生基線熒光信號。如果測試化合物抑制酶的活性，信號將會暫時性的降低，通過檢測熒光信號的強度就可以測定化合物抑制酶的活性。這種裝置每次進樣量 1～10nL，進樣同期10～30s。利用這個系統(tǒng)，每塊芯片可對幾千種化合物進行篩選。目前對該系統(tǒng)進行改進的努力主要集中在提高系統(tǒng)的耐用性和將不同類型的篩選方法移植到這個平臺上來。最新設計的微流體芯片將液體分發(fā)�；衔锵♂屌c篩選分析 3者集成起來，由于減少了被視為瓶頸的芯片使用前的準備步驟，使得該系統(tǒng)更加方便實用。
目前，致力于開發(fā)微流體芯片技術并將其應用于藥物篩選的公司有：Caliper Technologies，Orchid
BioSciences，ACLARA BioSciences，Li－Cor等。
3 生物芯片在毒理學研究中的應用
對藥物進行毒性評價，是藥物篩選過程中十分重要的一個環(huán)節(jié)�，F在毒理學家多采用鼠為模型通過動物實驗來確定藥物的潛在毒性。這些方法需要使用大劑量的藥物，花上幾年時間，花費巨大。 DNA芯片技術可將藥物毒性與基因表達特征聯(lián)系起來，通過基因表達分析便可確定藥物毒性，使得藥物毒性或不期望出現的效應在臨床實驗前得以確認。用DNA芯片可以在一個實驗中同時對成千上萬個基因的表達情況進行分析，為研究化學或藥物分子對生物系統(tǒng)的作用提供全新的線索。該技術可對單個或多個有害物質進行分析，確定化學物質在低劑量條件下的毒性，分析、推斷有毒物質對不同生物的毒性可比性。如果不同類型的有毒物質所對應的基因表達諾有特征性的規(guī)律，那么，通過比較對照樣品和有毒物質的基因表達譜，便可對各種不同的有毒物質進行分類，在此基礎上通過進一步建立合適的生物模型系統(tǒng)，便可通過基因表達港變化來反映藥物對人體的毒性。
已經有不少研究工作表明，利用DNA芯片預測化合物毒性和對毒性物質進行分類是可行的。 Waring等用15種已知的肝毒性化合物處理大鼠。這些毒物將對肝細胞造成多種傷害，如DNA 損傷、肝硬化、肝壞死和誘發(fā)肝癌等。從大鼠肝臟中提取RNA，用DNA芯片作基因表達分析。通過將基因表達結果與組織病理分析和臨床化學分析的結果進行比較，發(fā)現兩者有很強的相關性。該結果表明，DNA芯片分析是一種可以用來分析藥物安全性和對環(huán)境毒物進行分類的靈敏度較高的方法。在另一報道中他們用同樣的15種化合物作用大鼠的肝細胞，再用DNA芯片作基因表達分析，結果顯示具有相似毒性機制的化合物所獲得基因表達譜具有相似性。Gerhold等給大鼠服用苯巴比妥和地塞米松等藥物，使用寡核苷酸芯片，檢測了大鼠肝組織中與藥物代謝、毒性和能量代謝相關基因的表達。最后，通過分析基因表達變化的結果就可以推測藥物代謝與毒性的情況。Bartosiewicz等則利用 DNA芯片對環(huán)境毒物進行了檢測。
目前已有多種較為成熟的毒理學DNA芯片繼問世。美國國立環(huán)境衛(wèi)生研究院分子致癌機制實驗室的Barrett等人研制了一種名為ToxChip的 DNA芯片，可以靈敏的檢測有害化學物質對人體基因表達的作用（http：//dir，niehs．nih．gov/dirlmc/ lmcmain．htm）；Gene Logic公司的產品Flow－thru Chip已經試投入商業(yè)運用，可用以檢測藥物和毒物對生物體的影響，他們還建立了龐大的基因表達數據庫，可以用于藥物靶點確認和毒性預測（http：// www.genelogic．com/geneexp.asp）；Syngenta公司和AstraZeneca Pharmaceuticals公司的科學家設計制作了被稱為ToxBlot arrays的DNA芯片，其第代產品ToxBlot Ⅱ含有大約13000人的基因，包含了所有毒理學家感興趣的基因家族和信號通路；美國化學工業(yè)毒物研究所（Chemical Industry Insti tute of Toxicology）中專門有一個工作小組用微陣列 技術研究一些致癌毒物對人體的作用（http；// www．ciit．org/toxicogenomics/construction．html）
4 生物芯片在藥物基因組學中的應用
藥物基因組學是在基因組學的基礎上研究不個體對藥物反應的差異以便針對不同的基因型"量身定做"藥物，從而將藥物的藥效充分發(fā)揮而不良反應減少到最小。其優(yōu)點為：①在進入臨床試驗前，藥物基因組學可以通過化合物對基因多態(tài)性的影響挑選先導物，從而降低由于藥效的不穩(wěn)定導致的失敗幾率。②在Ⅰ期臨床試驗中，個體基因型可以預見基因多態(tài)性造成的藥物代謝動力學差異。③由于藥物作用靶蛋白的差異反映在基因多態(tài)性上，因此在Ⅱ期臨床試驗中，由個體基因型可以預見基因多態(tài)性造成的藥效差異，由此來指導Ⅲ期臨床試驗 ④一旦發(fā)現一種可以導致藥物作用差異的蛋白，其他與之相關的蛋白可作為潛在的藥物作用靶。
將DNA芯片技術應用于藥物基因組學，一方面可以加速藥物基因組學的發(fā)展，主要是利用DNA 芯片進行基因功能及其多態(tài)性的研究，以確認與藥物效應及藥物吸收、代謝、排泄等相關的基因，并查明這些基因的多態(tài)性；另一方面DNA芯片利用藥物基因組學的研究成果，根據基因型將人分群，以實現藥物基因組學研究的目的和價值。從這兩方面足以看到DNA芯片技術對藥物基因組學研究的影響之大。
DNA芯片可以自動、快速地檢測那些可以影響藥物效應的基因（如藥物代謝酶、藥物作用靶和致病因子的編碼基因）和決定個人對藥物毒性敏感性的基因。Evans和Relling就設想了一種急性原淋巴細胞白血病藥物基因組芯片，這種芯片上包括了所有可能影響急性原淋巴細胞白血病病人對化學治療反應的基因，借助這種芯片可以根據病人的基因型對病人分群，幫助醫(yī)生為每個病人選擇合適的治療藥物和藥物劑量。
5 生物芯片在藥物分析中的應用
生物芯片在藥物分析中的應用主要是指采用毛細管電泳芯片/質譜系統(tǒng)對化合物庫、血樣和尿樣中的藥物進行分析鑒定。毛細管電泳芯片/貢譜系統(tǒng)是指將毛細管電泳芯片和質譜聯(lián)用的一套裝置。毛細管電泳芯片進行樣品的分離，而與芯片聯(lián)用的質譜則有選擇性的對分離成分進行檢測。美國康奈爾大學的Wachs等發(fā)明了一種微型化的離子噴霧裝置。這種裝置適合于與基于芯片的分離裝置、多孔板或帶有待測樣品殘渣的表面聯(lián)用。這種裝置有兩種版本，一種稱為微型噴霧器，主要與毛細管電泳芯片聯(lián)用；另一種稱為小型噴霧器，它帶有伸長的吸樣毛細管，可以插入多孔板孔的底部，所以適合與多孔板聯(lián)用。這種裝置可以幫助人們對芯片分離所得樣品或多孔板中樣品進行質譜檢測。來自康奈爾大學同一個實驗室的Deng等將玻璃制成的毛細管電泳芯片與他們自己設計的微型離子噴霧裝置連接，使用PE公司的質譜系統(tǒng)做檢測，對多種藥物的標準和血漿樣品進行了分析檢測。實驗結果證明，使用毛細管電泳芯片/質譜系統(tǒng)對小分子化合物進行快速（30s）的檢測是可行的。這套裝置可以用來對合成的化合物庫和人血漿中重要成分進行分析檢測。Ramseier等用芯片毛細管電泳和使膠毛細管電泳檢測尿中苯丙胺及其類似物，實驗結果顯示芯片毛細管電泳的方法具有更快的分高速度和更高的分離效率。Chiem等則用毛細管電泳芯片檢測了血清中的茶堿。
6 結語
隨著一浪高過一浪的生物芯片技術研發(fā)熱潮，生物芯片技術在藥物研究與開發(fā)領域的應用也將更廣泛更深入。特別值得一提的是，在今天"回歸自然"思潮的影響下，天然藥物的開發(fā)成為一股強大的潮流，而中藥又以其豐富的資源、獨特的療效、較小的不良反應引起世界的關注；同時人們也認識到，從化學合成物中篩選新藥難度大、費用高、周期長，于是中藥的研究與開發(fā)已成為新藥研發(fā)的熱點。中藥現代化研究的難點就在于中藥成分的復雜性和中藥作用機制的復雜性。生物芯片由于具有高通量（或超高通量）、并行性、低消耗、微型化、自動化的特點，將尤其適合于中藥的研究與開發(fā)。例如香港城市大學的生物芯片研究小組就利用DNA微陣列芯片研究了中藥對腫瘤細胞基因表達的影響；他們還致力于開發(fā)能對中藥有效成分進行分離和篩選的生物芯片系統(tǒng)。香港理工大學的的研究小組采用DNA芯片對中藥進行基因分型，從而鑒定中藥的品種。生物芯片北京國家工程研究中心采用自行研制的酵母全基因組DNA芯片，與北京大學藥學院生物技術室合作研究了多種抗真菌中藥的作用機制�？梢灶A見，生物芯片技術將在中藥現代化研究與開發(fā)中大顯身手。
隨著中國加入WTO日程的日益臨近，我國的制藥工業(yè)面臨著知識產權保護的強大壓力。加緊研究開發(fā)具有自主知識產權的藥物已迫在眉睫。目前國外幾乎所有的大制藥公司都不約而同地采用了生物芯片技術。我國在該領域雖然起步較晚，但潛力較大，以此作為突破口，將生物芯片技術應用于創(chuàng)新藥物的研究與開發(fā)以及中醫(yī)藥現代化研究將一定能夠取得令人矚目的成績。
�。ㄉ镄酒本﹪夜こ萄芯恐行�，鄧沱，程京）（清華大學生物科學與技術系，鄧沱，周玉祥，程京）
生物芯片的概念源自于計算機芯片，狹義的生物芯片即微陣列芯片，主要包括cDNA微陣列、寡核苷酸微陣列、蛋白質微陣列和小分子化合物微陣列。分析的基本單位是在一定尺寸的基片（如硅片、玻璃、塑料等）表面以點陣方式固定的一系列可尋址的識別分子，點陣中每一個點都可以視為一個傳感器的探頭。芯片表面固定的分子在一定的條件下與被檢測物進行反應，其結果利用化學熒光法、酶標法。同位素法或電化學法顯示，再用掃描儀等儀器記錄，最后通過專門的計算機軟件進行分析。廣義的生物芯片是指能對生物成分或生物分子進行快速并行處理和分析的厘米見方的固體薄型器件，其主要種類有微陣列芯片、過濾分離芯片、介電電泳分離芯片、生化反應芯片和毛細管電泳芯片等。
隨著21世紀的到來，制藥公司正面臨著一次嚴峻的市場挑戰(zhàn)。這些公司為了保持或增強在市場上的競爭力，不得不尋求發(fā)展新的藥物開發(fā)技術以提高藥物發(fā)現的速度，縮短新藥上市的時間，減少藥物開發(fā)的成本。近年來生物芯片技術的飛速發(fā)展，引起了制藥業(yè)的極大興趣，使得生物芯片技術在藥物研究與開發(fā)領域得到越來越廣泛的應用，已逐漸滲入到藥物研發(fā)過程中的各個步驟。本文將主要討論生物芯片技術在藥物靶點發(fā)現與藥物作用機制研究、超高通量藥物篩選、毒理學研究、藥物基因組學研究以及藥物分析中的應用。
1 生物芯片在藥物靶點發(fā)現與藥物作用機制研究中的應用
藥物靶點發(fā)現與藥物作用機制研究是生物芯片技術在藥物研發(fā)中應用最為廣泛的一個領域。在藥物靶點發(fā)現和藥物作用機制研究中所使用的生物芯片主要是指DNA芯片。在DNA芯片的表面，以微陣列的方式固定有寡核苷酸或cDNA。使用DNA 芯片可以對研究者感興趣的基因或生物體整個基因組的基因表達進行測定。在當代藥物開發(fā)過程中發(fā)現和選擇合適的藥物靶點是藥物開發(fā)的第一步，也是藥物篩選及藥物定向合成的關鍵因素之一。人體是一個復雜的網絡系統(tǒng)，疾病的發(fā)生和發(fā)展必然牽涉到網絡中的諸多環(huán)節(jié)。當今嚴重威脅人類健康的心腦血管疾病、惡性腫瘤、老年性癡呆癥和一些代謝紊亂疾病都是多因素作用的結果，往往不能歸結于單一因素的變化。應用一些基因尋找策略如DD PCR等雖然為發(fā)現新的功能基因提供了一些線索，但還是有相當的局限性。而DNA芯片可以從疾病及藥物2個角度對生物體的多個參量同時進行研究以發(fā)掘藥物靶點并同時獲取大量其他相關信息。因此可以說，在這種情況下，任何一元化的分析方法均不及 DNA芯片這種集成化的分析手段更具有優(yōu)勢。
DNA芯片在藥物靶點發(fā)現與藥物作用機制研究中的應用具體表現在以下幾個方面。
1 比較正常不同組織細胞中基因的表達模式:
基因的表達模式給它的功能提供了間接的信息。例如只在腎臟中表達的基因就不大可能與精神分裂癥有關。一些藥物的靶點是在整個身體中分布廣泛的蛋白質，這類藥物的不良反應往往比較大。而選擇只在特異組織中才表達的蛋白作為藥物篩選的靶點，可以減少藥物對整體產生的不良反應，因而更引起人們的關注。例如骨質疏松癥（osteoporosis）與破骨細胞（osteoclasts）的功能有關，破骨細胞可以破壞并吸收骨質，當骨質的形成與破壞出現不平衡的時候，就會導致骨質疏松癥。如果破骨細胞的功能得到抑制，那么就可以控制骨質疏松癥的發(fā)生和發(fā)展。利用已有的人類EST序列和DNA芯片技術，可以容易地得到只在破骨細胞中進行表達的基因如 cathepsink基因，它編碼半胱氨酸蛋白酶。以 cathepsink基因作為靶標，篩選對它有抑制作用的藥物，就有可能得到治療骨質疏松癥的藥物。但是這種方法也有其局限性，它只能得到mRNA水平的表達譜，另外組織一般由多種細胞組成，而要將這些細胞分離很困難。
2 研究正常組織與病理組織基因表達差異
正常組織在病變的過程中，往往伴隨著基因表達模式的變化�；虮磉_水平的升高或降低，可能是病變的原因，也可能是病變的結果。若基因表達的變化是病變的原因，則以此基因為靶點的藥物就可能逆轉病變；若基因表達的變化是病變的結果，則以此基因為靶點的藥物就可能減輕病變的癥狀。DNA芯片技術可以在病理組織與正常組織之間一次比較成千上萬個基因的表達變化，找出病理組織中表達異常的基因。Heller等提取正常及誘發(fā)病變的巨噬細胞、軟骨細胞系、原代軟骨細胞和滑膜細胞的 mRNA，用包含細胞因子、趨化因子、DNA結合蛋白及基質降解金屬蛋白酶等幾大類基因的cDNA芯片進行篩選，發(fā)現了數種變化明顯的基因。其中除了有已知與類風濕關節(jié)炎有關的TNF，IL－1，IL－6，IL－ 8，G－CSF，RANTES，VCAM的基因外，還有編碼基質金屬彈性蛋白酶HME，IL-3，ICE，趨化因子Groα 等的基因。而以前認為金屬彈性蛋白酶只存在于肺泡巨噬細胞和胎盤細胞中。彈性蛋白酶可以破壞膠原纖維及組織基底膜層，它在類風濕關節(jié)炎病理組織中的出現，為治療該病提供了新的藥物靶點。
利用DNA芯片來尋找疾病相關基因的策略尤其適用于病因復雜的情況。例如，惡性腫瘤的發(fā)生常常是多基因共同作用的結果，DNA芯片技術在腫瘤細胞基因表達模式及腫瘤相關基因發(fā)掘中具有重要的作用。Wang等將一些看家基因、細胞因子及受體基因、細胞分裂相關基因及其他一些癌基因共5766個基因的cDNA探針固定在芯片上，對正常卵巢組織及卵巢癌組織的mRNA進行分析，發(fā)現二者之間30％基因表達相差2倍以上，9％相差3倍以上，其中上調較為明顯的有CD9．上皮糖蛋白（ep ithelial glycoprotein）、p27及HE蛋白激酶抑制物等。這些結果不僅進一步證實了以前用其他方法獲得的結果，還提供了一些新的信息。再如，Kapp 等用包含950個DNA探針的DNA芯片分析比較霍奇金病細胞系L428及KMH2與EB病毒永生化的B淋巴細胞系LGL－GK的基因表達港，發(fā)現霍奇金病源的細胞系中白細胞介素-13（IL－13）及白細胞介素-5（IL－5）表達異常增高；用IL－13抗體處理霍奇金病源的細胞系可顯著抑制其增殖。此發(fā)現提示，IL-13可能以自分泌形式促進霍奇金病相關細胞增殖。IL-13及其信號轉導途徑可能成為霍奇金病治療及藥物篩選的新靶點。
3 建立模式生物細胞中的基因表達模型
采用模式生物細胞進行試驗，條件容易控制，對模式生物基因表達的研究將啟發(fā)人們發(fā)現和確認新的藥物作用靶點。目前，已有多種模式生物（如酵母）的基因組計劃已經完成。釀酒酵母（saccharomvces cerevisi ae）就是一種可用來進行藥物篩選的較為理想的模式生物。它是真核生物而且基因組已全部測序，細胞繁殖快，易于培養(yǎng)，與哺乳動物細胞有許多共同的生化機制�，F在已經發(fā)現，在酵母細胞中存在許多與人類疾病相關的基因。如人類Werner''''s綜合征表現出早熟的特征，其細胞的生活周期變短。人類與此疾病相關的基因與酵母中編碼DNA解旋酶的 SGS1基因極為相似。Botstein等得到了SGS1基因突變的酵母菌株，此突變菌株生活周期變短，細胞的表型特征與患有Werner''''s綜合征入細胞相似。已有一些研究小組根據公布的酵母基因組序列，用PCR方法擴增了酵母6000多個開放閱讀框（open reading frame，ORF）片段，制成DNA芯片，在整個基因組的范圍內對酵母的基因表達進行檢測。
4 建立病原作基因的表達模型
由于病原體的基因組規(guī)模相對較小，可用包含其全部基因的DNA 芯片鑒定那些對人產生毒害作用的基因。異煙肼（isoniazid，INH）是治療肺結核的常用藥物，其治療結核病的機制是它阻斷了分枝茵酸的生物合成途徑。Wilson等根據已測序的肺結核桿菌基因組序列，用PCR方法擴增了3834個ORF（占全部 ORF的97％），固化在玻片上，制成檢測肺結核桿菌基因表達的DNA芯片。用INH處理敏感菌株，發(fā)現除了生化途徑已清楚的與分枝菌酸合成相關的一些基因轉錄水平發(fā)生變化外，還發(fā)現EfpA基因的表達也被誘導發(fā)生了變化，推測EfpA基因也參與了分枝菌酸的生物合成，而EfpA基因只在分枝菌屬中一些致病的種類中才存在，故EfpA基因可以作為治療結核病的新靶點。另外，分別用INH和 Ethionamide處理敏感菌株，獲得了相似的基因表達譜，證實了兩者具有相同的作用機制。
5 研究藥物處理細胞后基因未達變化
藥物與細胞（特別是敏感細胞）相互作用，將引起細胞外部形態(tài)及內部正常代謝過程的一系列變化。其內部生理活動的變化可集中表現在其基因表達的變化上。通過測定分析藥物對細胞的基因表達的影響，可推測藥物的作用機制，評價藥物活性及毒性，進而確證藥物靶點或者發(fā)現新的藥物靶點。通過DNA芯片測定藥物誘導的細胞基因表達變化來進行藥物篩選與研究，對那些用常規(guī)方法很難追蹤監(jiān)測的藥物或需要很長時間才能得到藥物臨床實驗結果時，顯得尤為有用。
通過監(jiān)測陽性藥物處理前后組織細胞基因表達變化情況可以獲得許多十分有價值的信息。首先，經藥物處理后表達明顯改變的基因往往與發(fā)病過程及藥物作用途徑密切相關，很可能是藥物作用的靶點或繼發(fā)事件，可作為進一步藥物篩選的靶點或對已有的靶點進行驗證；其次，藥物處理后基因表達的改變對藥物作用機制研究有一定的提示作用。
理論上講，藥物作用誘導的細胞基因表達變化應與缺失編碼該藥物作用靶點的基因引起的基因表達變化相似。Marton等使用含有6065個釀酒酵母的ORF的DNA芯片檢測發(fā)現，由免疫抑制劑 FK506誘導的的基因表達變化在缺失編碼被 FK506抑制的蛋白的基因變種中未觀察到，但在缺失與FK506作用無關的基因變種中卻視察到了。于是推測FK506除了與親免蛋白（immunophilins）結合外還有其他被忽略的作用靶（off－target）。在實驗基礎上，他們提出了所謂的解碼器戰(zhàn)略（decoder strategy），即首先比較經過藥物作用的野生株和缺失某些基因的變種株的基因表達譜，若二者相似，則將這種變種挑選出來，并將其與藥物作用。如果突變基因所編碼的蛋白質參與的生物途徑受藥物的影響，則藥物誘導該變種的基因表達變化與藥物誘導野生株基因表達變化將不同。用這種策略不僅可以確證藥物作用靶，還可以發(fā)現未曾引起人們注意的作用靶，并可從這些被忽略掉的靶中推測藥物的毒副作用。Cyclin依賴型激酶（cyclin－dependent kinas es，CDKs）在細胞增殖中有著重要的作用，是一種抗腫瘤藥物的靶點。Gray等從2，6，9，-三取代嘌呤化合物庫中篩選CDKs的抑制劑。他們將體外有活性的2種化合物flavopiridol和52（化合物代號）與酵母作用，然后用共含有260000個長度為25個堿基的一組寡聚核苷酸芯片檢測酵母基因表達變化。試驗結果表明，幾乎所有的已知與細胞周期相關的基因表達下調。雖然flavopiridol和52體外活性相似，但他們引起的酵母基因表達的變化卻有顯著的差異，表明二者對酵母的作用途徑是不一樣的。
鬼臼亞乙苷（etoposide）是p53活化拓撲異構酶 Ⅱ的抑制劑，在臨床上作為一種抗腫瘤藥物。Wang 等經用鬼臼亞已苷作用人成骨肉瘤細胞系U2－ OS后，根據不同的時間間隔分別提取細胞mRNA，用寡核苷酸芯片測定6591條mRNA表達百的變化，發(fā)現62條mRNA表達縣有變化。通過選取其中12條基因做進一步研究，發(fā)現有2條是已知的 p53調控基因（WAF1／p21和PCNA），有兩條是新的p53靶基因，其余的與p53無關。在實驗基礎上，他們提出了介導鬼臼亞乙苷誘導細胞凋亡的信號傳導途徑。此項研究工作使人們又多獲得一種抗腫痛藥物的靶點。
應用DNA芯片還可直接篩選特定的基因文庫以尋找藥物的作用靶點。如給酵母某一特定的呈單倍體狀態(tài)的基因對應的位置上放置一個遺傳標記，該標記可被DNA芯片所識別，那么通過比較藥物作用前后用芯片檢測整個文庫的結果，便有可能獲得藥物作用的靶基因。研究者稱此種篩選方式為 haploinsufficiency drug screen。
用DNA微陣列芯片進行藥物研究還存在如下一些缺點：①由于雜交樣品制備復雜，采用DNA微陣列芯片很難實現高通量。②DNA微陣列芯片只能用于檢測已知序列的基因。③由于靈敏度的限制，采用現存的DNA微陣列芯片難以檢測到表達水平很低的基因。
除了DNA芯片外，組織芯片、蛋白質芯片和細胞芯片也在藥物研究中嶄露頭角。最近，耶魯大學的研究小組首次報道了真核生物蛋白質組水平的蛋白質微陣列芯片。他們表達和純化了酵母的 5800種蛋白質，并將這些蛋白質點樣固定在載玻片上，制作了酵母蛋白質組微陣列芯片。他們使用這種芯片篩選能與特定蛋白質和磷脂相互作用蛋白質，發(fā)現了新的能與鈣調蛋白和磷脂相互作用的蛋白質。這種蛋白質微陣列芯片可以用于篩選與蛋白質相互作用的藥物，還可以用于檢測蛋白質翻譯后的修飾。他們的研究成果證實了制作和使用蛋白質組微陣列芯片進行功能分析檢測的可行性，并向人們預示了蛋白質微陣列芯片在藥物開發(fā)領域的廣闊應用前景。
Zlauddin和Sabatinl發(fā)明了一種細胞微陣列芯片。他們首先將不同的質粒DNA點在玻璃片上，做成質粒DNA做陣列芯片。接著用脂質轉染試劑處理該質粒DNA微陣列芯片，然后在處理好的質粒DNA微陣列上培養(yǎng)哺乳動物細胞。點在芯片上的質粒DNA在轉染試劑的幫助下原位轉染哺乳動物細胞，在質粒DNA微陣列的每一個質粒樣品點的相同位置形成了轉染了該質粒的細胞群。細胞因獲得了外源DNA而獲得了新的性狀。這樣，由質粒DNA芯片制成了由不同性狀細胞組成的細胞做陣列芯片。他們嘗試用這種細胞芯片來確證藥物作用靶點，尋找能改變細胞生理狀態(tài)的基因產物。這種新型細胞芯片可以用來在哺乳動物細胞內高通量篩選有可能成為候選先導分子的化合物、蛋白質或寡核苷酸。在功能基因組研究和藥物開發(fā)等領域具有很大的應用潛力。
2 生物芯片作為超高通量篩選平臺的應用
在過去的十幾年里，隨著科學的進步以及在巨大的經濟利益驅使下，藥物篩選技術得到了飛速的發(fā)展。在80年代中期（高通量篩選形成之初），每天只能篩選30種化合物，到90年代中期，每天可篩選1，500種化合物，而如今每天可篩選超過 100，000個化合物。高速、低成本的高通量篩選已成為當今藥物篩選的主流，并逐漸向超高通量方向發(fā)展。在過去的幾年中，世界上著名的制藥公司紛紛與以高通量藥物篩選技術為核心的中小型生物科技公司結盟或合作，采用高通量或超高通量藥物篩選技術進行先導物分子的篩選。要進一步提高篩選率，高通量篩選技術的各個方面均需要技術創(chuàng)新，這為生物芯片技術進入藥物篩選領域提供了寶貴的契機。
提高藥物篩選的通量，實現超高通量篩選有2 條途徑：一是微型化，一是自動化。生物芯片作為一種新型技術平臺，正可滿足超高通量篩選微型化和自動化的需要。生物芯片技術應用于超高通量篩選有2個發(fā)展方向：一是微孔板/微陣列技術，一是微流體芯片技術。
微孔板/微陳列技術
微孔板技術的發(fā)展主要表現在板孔數的增加。目前，使用最多的是96孔及384孔板，也有人使用1536孔、3456孔、甚至 9600孔板。如Oldenburg等報道了用9600孔板（0.2μL/孔）分析系統(tǒng)，以金屬蛋白酶為靶，對組合及分離純化的化合物庫進行篩選的結果。雖然隨著材料科學和加工技術的發(fā)展，微孔板技術有了長足的進步，但其發(fā)展面臨著一些不易解決的困難，主要有：微量液體極易蒸發(fā)，不適于那些不能用二甲亞砜（DMSO）作溶劑的篩選方法以及受限于當今還不夠完善的微量液體分配技術。
微陣列技術是將微孔板技術進一步微型化。最近，哈佛大學的研究人員開發(fā)了化合物微陣列芯片，主要用于篩選能與特定蛋白質特異性結合的化合物。他們將玻片表面進行化學處理，使其衍生化產生活性基團，然后將溶于有機溶劑中的化合物用機械手點在經處理的玻片表面，化合物與玻片表面的活性基團反應而被固定于玻片表面，這樣就將不同的化合物排布成微陣列，固定在玻片表面，制成化合物微陣列芯片。隨后將感興趣的蛋白質進行熒光標記，然后與微陣列芯片上的化合物反應，經清洗后，再進行熒光檢測就可以篩到能與這種蛋白質特異性結合的化合物。他們用化合物微陣列芯片進行了原理性實驗，其結果表明，使用這種化合物微陣列芯片可以并行、快速地進行大規(guī)模的化合物與蛋白質的結合篩選。他們最先是將玻璃片表面進行馬來酰亞胺衍生化處理，后來采用亞硫酰氯處理，都獲得了成功。他們還嘗試了使用這種化合物微陣列芯片進行大規(guī)模對映異構體的分型檢測。加利福尼亞大學Davis分校的科學家們采用類似的方法也制造了一種化合物微陣列芯片。他們對玻琥載玻片表面進行氨基化處理，在氨基玻片上進行乙醛酰衍生化，然后將帶有連接臂的配體分子點在修飾過的玻片表面。在進行化學連接反應之后，這種固定了不同小分子配體的微陣列芯片被用來進行了3種生物學檢測：蛋白質結合檢測、功能磷酸化檢測和活細胞粘附檢測。實驗結果證實了化合物微陣列芯片可以幫助我們對由組合合成方法獲得的大量化合物進行快速的功能分析和篩選。化合物微陣列芯片技術與基于微珠體的固相組合會成技術相結合為高通量藥物篩選帶來了一條新的途徑，將對高通量藥物篩選技術的發(fā)展產生積極的影響。
最近，出現了一種被稱為芯片膜片鉗（patch-on- a－chip）的新技術。在這種膜片鉗芯片上加工有檢測電信號的點陣，點陣中的每一個點是一個電信號記錄單元，同時每個點底部與負歷相通，可以吸位細胞。這樣膜片鉗芯片上的每一個點就可以實現傳統(tǒng)膜片鉗技術的功能。膜片鉗芯片具有操作簡單、快速和可實現高通量等優(yōu)點，可以用于電生理研究和高通量藥物篩選。位于美國圣地亞哥的AVIVA公司正在致力于此項技術的開發(fā)。
微流體芯片技術
微流體裝置的發(fā)展已廣泛用于生化及細胞的分析。鑒于這項技術在超高通量篩選中的巨大應用前景，吸引了眾多學術界和工業(yè)界的實驗室對該項技術的研究與開發(fā)。借用半導體工業(yè)中所用的光刻技術將內徑在10～100μm的做通道加工在玻璃或硅片中，利用電動泵和流體的壓力來控制皮、納升級液體的流動。該技術可減少幾個數量級的試劑消耗量，并能提高數據質量。它所采用的并行樣品處理程序可以獲得更高的篩選通量。多種類型的篩選分析方法在微流體芯片上操作的可行性（包括結合分析、酶分析和細胞分析）已得到實驗論證。
Jiang等制造了2種可以用于高通量檢測食物污染物和進行藥物篩選的微流體裝置。他們以硅為模板，采用模壓和毛細管成形技術在聚酯和多聚硅氧烷二甲酯中加工激流體網絡。在第1種裝置的微通道中夾著一塊PVDF（polyvinylidene fluoride）膜可用來結合、濃縮目標化合物，然后再直接通過質譜方法鑒定目標化合物。第2種裝置被用來超濾分離本巴比妥和苯巴比妥與抗體的復合物。整個過程包括上樣、清洗和解離都是連續(xù)進行的。這些微流體裝置不僅可以顯著降低系統(tǒng)死體積和所需樣品量，而且與先前報道的方法相比靈敏度至少可提高 1～2個數量級。
Capliper Technologies公司設計的芯片裝置，將從微孔板中取樣與隨后進行的酶抑制劑篩選結合在一起。目前，該芯片裝置已制作完成，并通過了測試。測試的化合物通過與芯片相連的硅毛細管注射入芯片中，與酶及熒光酶底物混合以使它們在主反應通道內發(fā)生相互作用。酶與熒光底物反應產生基線熒光信號。如果測試化合物抑制酶的活性，信號將會暫時性的降低，通過檢測熒光信號的強度就可以測定化合物抑制酶的活性。這種裝置每次進樣量 1～10nL，進樣同期10～30s。利用這個系統(tǒng)，每塊芯片可對幾千種化合物進行篩選。目前對該系統(tǒng)進行改進的努力主要集中在提高系統(tǒng)的耐用性和將不同類型的篩選方法移植到這個平臺上來。最新設計的微流體芯片將液體分發(fā)�；衔锵♂屌c篩選分析 3者集成起來，由于減少了被視為瓶頸的芯片使用前的準備步驟，使得該系統(tǒng)更加方便實用。
目前，致力于開發(fā)微流體芯片技術并將其應用于藥物篩選的公司有：Caliper Technologies，Orchid
BioSciences，ACLARA BioSciences，Li－Cor等。
3 生物芯片在毒理學研究中的應用
對藥物進行毒性評價，是藥物篩選過程中十分重要的一個環(huán)節(jié)�，F在毒理學家多采用鼠為模型通過動物實驗來確定藥物的潛在毒性。這些方法需要使用大劑量的藥物，花上幾年時間，花費巨大。 DNA芯片技術可將藥物毒性與基因表達特征聯(lián)系起來，通過基因表達分析便可確定藥物毒性，使得藥物毒性或不期望出現的效應在臨床實驗前得以確認。用DNA芯片可以在一個實驗中同時對成千上萬個基因的表達情況進行分析，為研究化學或藥物分子對生物系統(tǒng)的作用提供全新的線索。該技術可對單個或多個有害物質進行分析，確定化學物質在低劑量條件下的毒性，分析、推斷有毒物質對不同生物的毒性可比性。如果不同類型的有毒物質所對應的基因表達諾有特征性的規(guī)律，那么，通過比較對照樣品和有毒物質的基因表達譜，便可對各種不同的有毒物質進行分類，在此基礎上通過進一步建立合適的生物模型系統(tǒng)，便可通過基因表達港變化來反映藥物對人體的毒性。
已經有不少研究工作表明，利用DNA芯片預測化合物毒性和對毒性物質進行分類是可行的。 Waring等用15種已知的肝毒性化合物處理大鼠。這些毒物將對肝細胞造成多種傷害，如DNA 損傷、肝硬化、肝壞死和誘發(fā)肝癌等。從大鼠肝臟中提取RNA，用DNA芯片作基因表達分析。通過將基因表達結果與組織病理分析和臨床化學分析的結果進行比較，發(fā)現兩者有很強的相關性。該結果表明，DNA芯片分析是一種可以用來分析藥物安全性和對環(huán)境毒物進行分類的靈敏度較高的方法。在另一報道中他們用同樣的15種化合物作用大鼠的肝細胞，再用DNA芯片作基因表達分析，結果顯示具有相似毒性機制的化合物所獲得基因表達譜具有相似性。Gerhold等給大鼠服用苯巴比妥和地塞米松等藥物，使用寡核苷酸芯片，檢測了大鼠肝組織中與藥物代謝、毒性和能量代謝相關基因的表達。最后，通過分析基因表達變化的結果就可以推測藥物代謝與毒性的情況。Bartosiewicz等則利用 DNA芯片對環(huán)境毒物進行了檢測。
目前已有多種較為成熟的毒理學DNA芯片繼問世。美國國立環(huán)境衛(wèi)生研究院分子致癌機制實驗室的Barrett等人研制了一種名為ToxChip的 DNA芯片，可以靈敏的檢測有害化學物質對人體基因表達的作用（http：//dir，niehs．nih．gov/dirlmc/ lmcmain．htm）；Gene Logic公司的產品Flow－thru Chip已經試投入商業(yè)運用，可用以檢測藥物和毒物對生物體的影響，他們還建立了龐大的基因表達數據庫，可以用于藥物靶點確認和毒性預測（http：// www.genelogic．com/geneexp.asp）；Syngenta公司和AstraZeneca Pharmaceuticals公司的科學家設計制作了被稱為ToxBlot arrays的DNA芯片，其第代產品ToxBlot Ⅱ含有大約13000人的基因，包含了所有毒理學家感興趣的基因家族和信號通路；美國化學工業(yè)毒物研究所（Chemical Industry Insti tute of Toxicology）中專門有一個工作小組用微陣列 技術研究一些致癌毒物對人體的作用（http；// www．ciit．org/toxicogenomics/construction．html）
4 生物芯片在藥物基因組學中的應用
藥物基因組學是在基因組學的基礎上研究不個體對藥物反應的差異以便針對不同的基因型"量身定做"藥物，從而將藥物的藥效充分發(fā)揮而不良反應減少到最小。其優(yōu)點為：①在進入臨床試驗前，藥物基因組學可以通過化合物對基因多態(tài)性的影響挑選先導物，從而降低由于藥效的不穩(wěn)定導致的失敗幾率。②在Ⅰ期臨床試驗中，個體基因型可以預見基因多態(tài)性造成的藥物代謝動力學差異。③由于藥物作用靶蛋白的差異反映在基因多態(tài)性上，因此在Ⅱ期臨床試驗中，由個體基因型可以預見基因多態(tài)性造成的藥效差異，由此來指導Ⅲ期臨床試驗 ④一旦發(fā)現一種可以導致藥物作用差異的蛋白，其他與之相關的蛋白可作為潛在的藥物作用靶。
將DNA芯片技術應用于藥物基因組學，一方面可以加速藥物基因組學的發(fā)展，主要是利用DNA 芯片進行基因功能及其多態(tài)性的研究，以確認與藥物效應及藥物吸收、代謝、排泄等相關的基因，并查明這些基因的多態(tài)性；另一方面DNA芯片利用藥物基因組學的研究成果，根據基因型將人分群，以實現藥物基因組學研究的目的和價值。從這兩方面足以看到DNA芯片技術對藥物基因組學研究的影響之大。
DNA芯片可以自動、快速地檢測那些可以影響藥物效應的基因（如藥物代謝酶、藥物作用靶和致病因子的編碼基因）和決定個人對藥物毒性敏感性的基因。Evans和Relling就設想了一種急性原淋巴細胞白血病藥物基因組芯片，這種芯片上包括了所有可能影響急性原淋巴細胞白血病病人對化學治療反應的基因，借助這種芯片可以根據病人的基因型對病人分群，幫助醫(yī)生為每個病人選擇合適的治療藥物和藥物劑量。
5 生物芯片在藥物分析中的應用
生物芯片在藥物分析中的應用主要是指采用毛細管電泳芯片/質譜系統(tǒng)對化合物庫、血樣和尿樣中的藥物進行分析鑒定。毛細管電泳芯片/貢譜系統(tǒng)是指將毛細管電泳芯片和質譜聯(lián)用的一套裝置。毛細管電泳芯片進行樣品的分離，而與芯片聯(lián)用的質譜則有選擇性的對分離成分進行檢測。美國康奈爾大學的Wachs等發(fā)明了一種微型化的離子噴霧裝置。這種裝置適合于與基于芯片的分離裝置、多孔板或帶有待測樣品殘渣的表面聯(lián)用。這種裝置有兩種版本，一種稱為微型噴霧器，主要與毛細管電泳芯片聯(lián)用；另一種稱為小型噴霧器，它帶有伸長的吸樣毛細管，可以插入多孔板孔的底部，所以適合與多孔板聯(lián)用。這種裝置可以幫助人們對芯片分離所得樣品或多孔板中樣品進行質譜檢測。來自康奈爾大學同一個實驗室的Deng等將玻璃制成的毛細管電泳芯片與他們自己設計的微型離子噴霧裝置連接，使用PE公司的質譜系統(tǒng)做檢測，對多種藥物的標準和血漿樣品進行了分析檢測。實驗結果證明，使用毛細管電泳芯片/質譜系統(tǒng)對小分子化合物進行快速（30s）的檢測是可行的。這套裝置可以用來對合成的化合物庫和人血漿中重要成分進行分析檢測。Ramseier等用芯片毛細管電泳和使膠毛細管電泳檢測尿中苯丙胺及其類似物，實驗結果顯示芯片毛細管電泳的方法具有更快的分高速度和更高的分離效率。Chiem等則用毛細管電泳芯片檢測了血清中的茶堿。
6 結語
隨著一浪高過一浪的生物芯片技術研發(fā)熱潮，生物芯片技術在藥物研究與開發(fā)領域的應用也將更廣泛更深入。特別值得一提的是，在今天"回歸自然"思潮的影響下，天然藥物的開發(fā)成為一股強大的潮流，而中藥又以其豐富的資源、獨特的療效、較小的不良反應引起世界的關注；同時人們也認識到，從化學合成物中篩選新藥難度大、費用高、周期長，于是中藥的研究與開發(fā)已成為新藥研發(fā)的熱點。中藥現代化研究的難點就在于中藥成分的復雜性和中藥作用機制的復雜性。生物芯片由于具有高通量（或超高通量）、并行性、低消耗、微型化、自動化的特點，將尤其適合于中藥的研究與開發(fā)。例如香港城市大學的生物芯片研究小組就利用DNA微陣列芯片研究了中藥對腫瘤細胞基因表達的影響；他們還致力于開發(fā)能對中藥有效成分進行分離和篩選的生物芯片系統(tǒng)。香港理工大學的的研究小組采用DNA芯片對中藥進行基因分型，從而鑒定中藥的品種。生物芯片北京國家工程研究中心采用自行研制的酵母全基因組DNA芯片，與北京大學藥學院生物技術室合作研究了多種抗真菌中藥的作用機制�？梢灶A見，生物芯片技術將在中藥現代化研究與開發(fā)中大顯身手。
隨著中國加入WTO日程的日益臨近，我國的制藥工業(yè)面臨著知識產權保護的強大壓力。加緊研究開發(fā)具有自主知識產權的藥物已迫在眉睫。目前國外幾乎所有的大制藥公司都不約而同地采用了生物芯片技術。我國在該領域雖然起步較晚，但潛力較大，以此作為突破口，將生物芯片技術應用于創(chuàng)新藥物的研究與開發(fā)以及中醫(yī)藥現代化研究將一定能夠取得令人矚目的成績。
�。ㄉ镄酒本﹪夜こ萄芯恐行�，鄧沱，程京）（清華大學生物科學與技術系，鄧沱，周玉祥，程京）
標簽：
生物芯片技術 藥物R&D 應用
