基因芯片技術(shù)及其研究現(xiàn)狀和應(yīng)用前景

　　摘要：基因芯片技術(shù)是90年代中期以來快速發(fā)展起來的分子生物學(xué)高新技術(shù)，是各學(xué)科交叉綜合的嶄新科學(xué)。其原理是采用光導(dǎo)原位合成或顯微印刷等方法，將大量DNA探針片段有序地固化予支持物的表面，然后與已標記的生物樣品中DNA分子雜交，再對雜交信號進行檢測分析，就可得出該樣品的遺傳信息。基因芯片技術(shù)目前國內(nèi)外都取得了較大的進展，該技術(shù)可用于DNA測序，基因表達及基因組圖的研究，基因診斷，新基因的發(fā)現(xiàn)，藥物篩選，給藥個性化等等，所以為二十一世紀生物醫(yī)藥鋪平道路，將為整個人類社會帶來深刻廣泛的變革，促進人類早日進入生物信息時代。

　　
　　生物芯片技術(shù)是隨著"人類基因組計劃"（human genome project, HGP）的進展而發(fā)展起來的，它是90年代中期以來影響最深遠的重大科技進展之一，它融微電子學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、計算機科學(xué)為一體的高度交叉的新技術(shù)，具有重大的基礎(chǔ)研究價值，又具有明顯的產(chǎn)業(yè)化前景。生物芯片技術(shù)包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細胞芯片、組織芯片、以及元件型微陣列芯片、通道型微陣列芯片、生物傳感芯片等新型生物芯片（1）。本文主要討論基因芯片技術(shù)，它為"后基因組計劃"時期基因功能的研究提供了強有力的工具，將會使基因診斷、藥物篩選、給藥個性化等方面取得重大突破，該技術(shù)被評為1998年度世界十大科技進展之一。

　　1 基本概念

　　基因芯片（gene chip）也叫DNA芯片、DNA微陣列（DNA microarray）、寡核苷酸陣列（oligonucleotide array），是指采用原位合成（in situ synthesis）或顯微打印手段，將數(shù)以萬計的DNA探針固化于支持物表面上，產(chǎn)生二維DNA探針陣列，然后與標記的樣品進行雜交，通過檢測雜交信號來實現(xiàn)對生物樣品快速、并行、高效地檢測或醫(yī)學(xué)診斷，由于常用硅芯片作為固相支持物，且在制備過程運用了計算機芯片的制備技術(shù)，所以稱之為基因芯片技術(shù)。

　　2 技術(shù)基本過程

　　2．1 DNA方陣的構(gòu)建

　　選擇硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、尼龍膜等支持物，并作相應(yīng)處理，然后采用光導(dǎo)化學(xué)合成和照相平板印刷技術(shù)可在硅片等表面合成寡核苷酸探針;（2）或者通過液相化學(xué)合成寡核苷酸鏈探針，或PCR技術(shù)擴增基因序列，再純化、定量分析，由陣列復(fù)制器（arraying and replicating device ARD），或陣列機（arrayer）及電腦控制的機器人，準確、快速地將不同探針樣品定量點樣于帶正電荷的尼龍膜或硅片等相應(yīng)位置上，再由紫外線交聯(lián)固定后即得到DNA微陣列或芯片（3）。

　　2．2 樣品DNA或mRNA的準備。

　　從血液或活組織中獲取的DNA/mRNA樣品在標記成為探針以前必須進行擴增提高閱讀靈敏度。Mosaic Technologies公司發(fā)展了一種固相PCR系統(tǒng)，好于傳統(tǒng)PCR技術(shù)，他們在靶DNA上設(shè)計一對雙向引物，將其排列在丙烯酰胺薄膜上，這種方法無交叉污染且省去液相處理的繁鎖；Lynx Therapeutics公司提出另一個革新的方法，即大規(guī)模平行固相克�。╩assively parallel solid-phase cloning）這個方法可以對一個樣品中數(shù)以萬計的DNA片段同時進行克隆，且不必分離和單獨處理每個克隆，使樣品擴增更為有效快速（4）。

　　在PCR擴增過程中，必須同時進行樣品標記，標記方法有熒光標記法、生物素標記法、同位素標記法等。

　　2．3 分子雜交

　　樣品DNA與探針DNA互補雜交要根據(jù)探針的類型和長度以及芯片的應(yīng)用來選擇、優(yōu)化雜交條件。如用于基因表達監(jiān)測，雜交的嚴格性較低、低溫、時間長、鹽濃度高；若用于突變檢測，則雜交條件相反（5）。芯片分子雜交的特點是探針固化，樣品熒光標記，一次可以對大量生物樣品進行檢測分析，雜交過程只要30min。美國Nangon公司采用控制電場的方式，使分子雜交速度縮到1min，甚至幾秒鐘（6）。德國癌癥研究院的Jorg Hoheisel等認為以肽核酸（PNA）為探針效果更好。

　　2．4 雜交圖譜的檢測和分析

　　用激光激發(fā)芯片上的樣品發(fā)射熒光，嚴格配對的雜交分子，其熱力學(xué)穩(wěn)定性較高，熒光強；不完全雜交的雙鍵分子熱力學(xué)穩(wěn)定性低，熒光信號弱（不到前者的1/35~1/5）（2），不雜交的無熒光。不同位點信號被激光共焦顯微鏡，或落射熒光顯微鏡等檢測到，由計算機軟件處理分析，得到有關(guān)基因圖譜。目前，如質(zhì)譜法、化學(xué)發(fā)光法、光導(dǎo)纖維法等更靈敏`、快速，有取代熒光法的趨勢。

　　3 應(yīng)用

　　3．1 測序

　　基因芯片利用固定探針與樣品進行分子雜交產(chǎn)生的雜交圖譜而排列出待測樣品的序列，這種測定方法快速而具有十分誘人的前景。Mark chee等用含135000個寡核苷酸探針的陣列測定了全長為16.6kb的人線粒體基因組序列，準確率達99%（7）。Hacia等用含有48000個寡核苷酸的高密度微陣列分析了黑猩猩和人BRCA1基因序列差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在外顯子11約3.4kb長度范圍內(nèi)的核酸序列同源性在98.2%到83.5%之間，提示了二者在進化上的高度相似性（8）。

　　3．2 基因表達水平的檢測。

　　用基因芯片進行的表達水平檢測可自動、快速地檢測出成千上萬個基因的表達情況。Schena等采用擬南芥基因組內(nèi)共45個基因的cDNA微陣列（其中14個為完全序列，31個為EST），檢測該植物的根、葉組織內(nèi)這些基因的表達水平，用不同顏色的熒光素標記逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物后分別與該微陣列雜交，經(jīng)激光共聚焦顯微掃描，發(fā)現(xiàn)該植物根和葉組織中存在26個基因的表達差異，而參與葉綠素合成的CAB1基因在葉組織較根組織表達高500倍。（9）Schena等用人外周血淋巴細胞的cDNA文庫構(gòu)建一個代表1046個基因的cDNA微陣列，來檢測體外培養(yǎng)的T細胞對熱休克反應(yīng)后不同基因表達的差異，發(fā)現(xiàn)有5個基因在處理后存在非常明顯的高表達，11個基因中度表達增加和6個基因表達明顯抑制。該結(jié)果還用熒光素交換標記對照和處理組及RNA印跡方法證實（10）。在HGP完成之后，用于檢測在不同生理、病理條件下的人類所有基因表達變化的基因組芯片為期不遠了（11）。


3．3 基因診斷
　　從正常人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出標準圖譜。從病人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出病變圖譜。通過比較、分析這兩種圖譜，就可以得出病變的DNA信息。這種基因芯片診斷技術(shù)以其快速、高效、敏感、經(jīng)濟、平行化、自動化等特點，將成為一項現(xiàn)代化診斷新技術(shù)。例如，Affymetrix公司，把P53基因全長序列和已知突變的探針集成在芯片上，制成P53基因芯片，將在癌癥早期診斷中發(fā)揮作用。又如，Heller等構(gòu)建了96個基因的cDNA微陣，用于檢測分析風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）相關(guān)的基因，以探討DNA芯片在感染性疾病診斷方面的應(yīng)用（12）。現(xiàn)在，肝炎病毒檢測診斷芯片、結(jié)核桿菌耐藥性檢測芯片、多種惡性腫瘤相關(guān)病毒基因芯片等一系列診斷芯片逐步開始進入市場。基因診斷是基因芯片中最具有商業(yè)化價值的應(yīng)用。

　　3．4 藥物篩選

　　如何分離和鑒定藥的有效成份是目前中藥產(chǎn)業(yè)和傳統(tǒng)的西藥開發(fā)遇到的重大障礙，基因芯片技術(shù)是解決這一障礙的有效手段，它能夠大規(guī)模地篩選、通用性強，能夠從基因水平解釋藥物的作用機理，即可以利用基因芯片分析用藥前后機體的不同組織、器官基因表達的差異。如果再用m RNA 構(gòu)建c DNA表達文庫,然后用得到的肽庫制作肽芯片,則可以從眾多的藥物成分中篩選到起作用的部分物質(zhì)�；蛘�,利用RNA、單鏈DNA有很大的柔性，能形成復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，更有利與靶分子相結(jié)合，可將核酸庫中的RNA或單鏈DNA固定在芯片上，然后與靶蛋白孵育，形成蛋白質(zhì)-RNA或蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，可以篩選特異的藥物蛋白或核酸，因此芯片技術(shù)和RNA庫的結(jié)合在藥物篩選中將得到廣泛應(yīng)用。在尋找HIV藥物中，Jellis等用組合化學(xué)合成及DNA芯片技術(shù)篩選了654536種硫代磷酸八聚核苷酸，并從中確定了具有XXG4XX樣結(jié)構(gòu)的抑制物，實驗表明，這種篩選物對HIV感染細胞有明顯阻斷作用。（13）生物芯片技術(shù)使得藥物篩選，靶基因鑒別和新藥測試的速度大大提高，成本大大降低。基因芯片藥物篩選技術(shù)工作目前剛剛起步，美國很多制藥公司已開始前期工作，即正在建立表達譜數(shù)據(jù)庫，從而為藥物篩選提供各種靶基因及分析手段。這一技術(shù)具有很大的潛在應(yīng)用價值。

　　3．5 給藥個性化

　　臨床上，同樣藥物的劑量對病人甲有效可能對病人乙不起作用，而對病人丙則可能有副作用。在藥物療效與副作用方面，病人的反應(yīng)差異很大。這主要是由于病人遺傳學(xué)上存在差異，如藥物應(yīng)答基因，導(dǎo)致對藥物產(chǎn)生不同的反應(yīng)。例如細胞色素P450酶與大約25%廣泛使用的藥物的代謝有關(guān)，如果病人該酶的基因發(fā)生突變就會對降壓藥異喹胍產(chǎn)生明顯的副作用，大約5%~10%的高加索人缺乏該酶基因的活性�，F(xiàn)已弄清楚這類基因存在廣泛變異，這些變異除對藥物產(chǎn)生不同反應(yīng)外，還與易犯各種疾病如腫瘤、自身免疫病和帕金森病有關(guān)。如果利用基因芯片技術(shù)對患者先進行診斷，再開處方，就可對病人實施個體優(yōu)化治療。另一方面，在治療中，很多同種疾病的具體病因是因人而異的，用藥也應(yīng)因人而異。例如乙肝有較多亞型，HBV基因的多個位點如S,P及C基因區(qū)易發(fā)生變異。若用乙肝病毒基因多態(tài)性檢測芯片每隔一段時間就檢測一次，這對指導(dǎo)用藥防止乙肝病毒耐藥性很有意義。又如，現(xiàn)用于治療AIDS的藥物主要是病毒逆轉(zhuǎn)錄酶RT和蛋白酶PRO的抑制劑，但在用藥3-12月后常出現(xiàn)耐藥，其原因是rt、pro基因產(chǎn)生一個或多個點突變。Rt基因四個常見突變位點是Asp67→Asn、Lys70→Arg、Thr215→Phe、Tyr和Lys219→Glu,四個位點均突變較單一位點突變后對藥物的耐受能力成百倍增加（14）。如將這些基因突變部位的全部序列構(gòu)建為DNA芯片，則可快速地檢測病人是這一個或那一個或多個基因發(fā)生突變，從而可對癥下藥，所以對指導(dǎo)治療和預(yù)后有很大的意義。

　　此外，基因芯片在新基因發(fā)現(xiàn)、藥物基因組圖、中藥物種鑒定、DNA計算機研究等方面都有巨大應(yīng)用價值。

　　4 基因芯片國內(nèi)外現(xiàn)狀和前景

　　自從1996年美國Affymetrix公司成功地制作出世界上首批用于藥物篩選和實驗室試驗用的生物芯片，并制作出芯片系統(tǒng)（15），此后世界各國在芯片研究方面快速前進，不斷有新的突破。美國的Hyseq公司、Syntexi公司、Nanogen公司、Incyte公司及日本、歐洲各國都積極開展DNA芯片研究工作；摩托羅拉、惠普、IBM等跨國公司也相繼投以巨資開展芯片研究。98年12月Affymefrix公司和Molecular Dynamics公司宣布成立基因分析協(xié)會（Genetic Analysis Technology Consortium）以制定一個統(tǒng)一的技術(shù)平臺生產(chǎn)更有效而價謙的設(shè)備，與此相呼應(yīng)，英國的Amershcem Pharmacia Biotechnology公司也在同一天宣布將提供部分掌握的技術(shù)以推動這項技術(shù)的應(yīng)用（16）。美國關(guān)于芯片技術(shù)召開了兩次會議，克林頓總統(tǒng)在會上高度贊賞和肯定該技術(shù)，將基因芯片看作是保證一生健康的指南針（17）。預(yù)計在今后五年內(nèi)生物芯片銷售可達200-300億美元；據(jù)《財富》雜志預(yù)測（97.3），在21世紀，生物芯片對人類的影響將可能超過微電子芯片。

　　我國在生物芯片研究方面剛剛起步，以97香山會議以來，我國對生物芯片高度重視，98年10月，中科院將基因芯片列為"九五"特別支持項目，利用中科院在微電子技術(shù)、生化技術(shù)、物理檢測技術(shù)方面的優(yōu)勢，組織跨所、跨學(xué)科合作�，F(xiàn)在以中科院上海冶金所為龍頭，與上海原子核所、有機所、生化所、遺傳所、腫瘤所、武漢病毒所、上海醫(yī)科大學(xué)、上海市疾病檢測中心、華東師大等單位組成強強聯(lián)合，在微陣列芯片和基于MEBS的芯片方面有大的突破，在DNA芯片設(shè)計、基片修飾、探針固定、樣品標記、雜交和檢測等方面的技術(shù)都有較大的進展，已研制出肝癌基因差異表達芯片、乙肝病毒多態(tài)性檢測芯片、多種惡性腫瘤病毒基因芯片等有一定實用意義的基因芯片和DNA芯片檢測儀樣機。中科院上海冶金所等又將在徐元森院士、趙建龍博士等帶領(lǐng)下，決心開發(fā)重大傳染性疾病的診斷芯片及檢測設(shè)備，如HBV、HCV、TB三種基因診斷芯片。上海細胞所正在進行人類全套基因組的cDNA陣列和微陣列制備，為我國科研和開發(fā)提供一個技術(shù)平臺，并使之產(chǎn)業(yè)化。同時，清華、復(fù)旦、東南大學(xué)、北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院、華東理工大學(xué)、第一軍醫(yī)大學(xué)等單位都在積極進行芯片研究。2000年國際生物芯片技術(shù)大會于10月11-14在北京召開，這又是對我國生物芯片技術(shù)有很大的促進作用

總之，我國基因芯片研究也緊跟國際前沿，力爭在此高新技術(shù)領(lǐng)域里有一席之地，它將對我國生命科學(xué)研究，醫(yī)學(xué)診斷，新藥篩選具有革命性的推動作用，也將對我國人口素質(zhì)、農(nóng)業(yè)發(fā)展、環(huán)境保護等作出具大的貢獻，同時帶動我國科學(xué)整體進步，為各相關(guān)高科技產(chǎn)業(yè)創(chuàng)造機會�；�因芯片將成為21世紀最令人注目的高新技術(shù)領(lǐng)域之一，將使人類早日進入生物信息時代。

　　陳華友，崔振玲（上海200062華東師范大學(xué)生物系分子生物學(xué)實驗室）