流式細(xì)胞儀Annexin V凋亡試劑盒一般染色檢測(cè)方法

1.把將被染色分析的細(xì)胞用冷PBS洗滌二次并在恰當(dāng)?shù)娜旧�緩沖液（binding buffer）中以1 x 106 細(xì)胞/mL的濃度重懸。（染色緩沖液，binding buffer,中必須含有鈣離子）

2.吸取100ul的細(xì)胞(1 x 105)至試管中。（必須在室溫下進(jìn)行）

3.加入適量的熒光標(biāo)記的annexin V試劑和PI。（必須在室溫下進(jìn)行）

4.混勻后避光室溫下孵育15分鐘。（必須在室溫下進(jìn)行）

5. 孵育后加入400ul染色緩沖液，立即上流式細(xì)胞儀分析。（實(shí)驗(yàn)必須在一小時(shí)內(nèi)完成，否則無意義�。�
我們推薦另外制備三個(gè)質(zhì)控樣本來設(shè)定流式細(xì)胞儀的熒光補(bǔ)償和設(shè)置十字門的范圍：
a) 沒有染色的細(xì)胞;
b) 僅用熒光標(biāo)記的annexin V染色的細(xì)胞;
c) 僅用PI染色的細(xì)胞.
annexin V和PI雙陽(yáng)性可以說明細(xì)胞群體中含有死亡細(xì)胞。我們推薦可以使用一個(gè)細(xì)胞系來制備以上三個(gè)對(duì)照管來作為annexin V和PI陽(yáng)性染色對(duì)照�？梢允褂迷赗PMI +10% FCS + 2-4 ng/mL的TNF-a孵育2-3小時(shí)的人U-937細(xì)胞，或在培養(yǎng)液中孵育1-2小時(shí)鼠淋巴細(xì)胞作為對(duì)照細(xì)胞。

請(qǐng)依據(jù)以下建議來正確設(shè)置儀器補(bǔ)償。以下方案可以根據(jù)不同的細(xì)胞類型稍加修改。

在流式細(xì)胞儀上分析經(jīng)染色的細(xì)胞:
使用流式細(xì)胞儀正確分析annexin V-FITC和PI雙標(biāo)的細(xì)胞要求儀器的熒光補(bǔ)償來去除兩種染料激發(fā)光之間的疊加。因?yàn)闊晒庋a(bǔ)償設(shè)置與PMT的電壓直接相關(guān)，所以不同儀器之間的補(bǔ)償不同。我們建議在實(shí)驗(yàn)開始階段分析單染的細(xì)胞來調(diào)整熒光補(bǔ)償去除光譜重疊。
1. 上樣未經(jīng)染色的細(xì)胞，在線性FS-SS點(diǎn)圖上顯示細(xì)胞并設(shè)門圈出目標(biāo)細(xì)胞群體。
注意：細(xì)胞在經(jīng)培養(yǎng)后光散射信號(hào)會(huì)發(fā)生變化。要注意使用側(cè)向散射光設(shè)門來識(shí)別出這些已改變的細(xì)胞。

2.建立LogFL1-LogFL2雙參數(shù)點(diǎn)圖并分析以上光散射圖中設(shè)門的細(xì)胞；保證>98%的細(xì)胞處于在X、Y軸Log 1為邊界的左下象限中心區(qū)域。

3. 檢測(cè)annexin V-FITC單染的細(xì)胞并檢查FL1-FL2散點(diǎn)圖，保證在左上和右上象限內(nèi)沒有顆粒。如果有顆粒出現(xiàn)在上端象限則說明有熒光滲漏；此時(shí)FL1的熒光被FL2 PMT檢測(cè)到了。為了糾正這種現(xiàn)象，增加FL1漏到FL2熒光的補(bǔ)償%（這可能在1-5%之間）。如果這個(gè)調(diào)節(jié)沒有有效地去除FL2的陽(yáng)性信號(hào)，此時(shí)要降低FL2 PMT的電壓。

4. 檢測(cè)PI單染的細(xì)胞并檢查FL1-FL2散點(diǎn)圖，保證在右上和右下象限內(nèi)沒有顆粒。如果有顆粒出現(xiàn)在右側(cè)象限則說明有熒光滲漏；此時(shí)PI的熒光被FL1 PMT檢測(cè)到了。為了糾正這種現(xiàn)象，增加FL2漏到FL1熒光的補(bǔ)償%（這可能在15-25%之間）。如果這個(gè)調(diào)節(jié)沒有有效地去除FL1的陽(yáng)性信號(hào)，此時(shí)要降低FL1 PMT的電壓。

5. 如果在以上調(diào)節(jié)補(bǔ)償過程中更改了PMT的電壓，我們建議重復(fù)3、4步驟，確保不引起過度熒光補(bǔ)償。過度補(bǔ)償可以從陽(yáng)性細(xì)胞十分貼近從標(biāo)這一現(xiàn)象觀察出來。一個(gè)恰當(dāng)?shù)难a(bǔ)償應(yīng)該是單陽(yáng)性細(xì)胞熒光強(qiáng)度與落在左下Log 1為邊界象限中間陰性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度一致。

6.因?yàn)樵S多未處理的細(xì)胞群體中存在一定數(shù)量的annexin V和PI雙陽(yáng)性的細(xì)胞，運(yùn)用annexin V試劑盒來檢測(cè)凋亡必須從處理過的細(xì)胞中扣除這些原本就存在的雙陽(yáng)性細(xì)胞。

7.根據(jù)未處理細(xì)胞或?qū)φ占?xì)胞經(jīng)annexin V和PI染色后在流式細(xì)胞上分析的結(jié)果來設(shè)定十字門的位置，F(xiàn)L1和FL2的劃定方法如下：
a. 設(shè)定FL1標(biāo)尺位置: 處于左下象限內(nèi)的大群細(xì)胞是annexin V染色陰性的細(xì)胞（一般這些細(xì)胞會(huì)在FL1軸方向上升至2個(gè)對(duì)數(shù)坐標(biāo)值）。將垂直的FL1標(biāo)尺設(shè)定在緊靠annexin V陰性群體右側(cè)0.1-0.2Log單位的地方。
b. 設(shè)定FL2標(biāo)尺位置: 可以通過一定數(shù)據(jù)的雙陽(yáng)性細(xì)胞來區(qū)分PI+和PI-的細(xì)胞群體。在此條件下可能會(huì)識(shí)別出兩群細(xì)胞，一是位于散點(diǎn)圖的右下方（ANN+/PI-）還有就是右上方（ANN+/PI+）。水平線可以置于這兩群細(xì)胞的中間。如果在分析的細(xì)胞群體中沒有PI+細(xì)胞，區(qū)分PI+細(xì)胞最好是參照雙陰性細(xì)胞群體，將水平線設(shè)在雙陰性細(xì)胞以上0.1-0.3 Log單位的地方。理想中，以上介紹的設(shè)門方法可以適用于任何細(xì)胞群體來設(shè)定十字門的位置。

8. 經(jīng)處理過的細(xì)胞此時(shí)可以用annexin V 和PI染色后在流式細(xì)胞儀上分析。那些在在陰性群體門以外的細(xì)胞可被識(shí)為annexin V或annexin V和PI陽(yáng)性的細(xì)胞。


注意：建議細(xì)胞經(jīng)染色盡快分析。盡管此處沒有推薦使用經(jīng)1%甲醛固定的細(xì)胞，但它在某些實(shí)驗(yàn)中可用它作為annexin V和PI雙染陽(yáng)性對(duì)照使用。制備以上對(duì)照可將細(xì)胞重懸在1X的染色緩沖液和固定劑混合液中。然而這個(gè)步驟會(huì)明顯地降低annexin V和PI的染色熒光強(qiáng)度。