ELISA 臨床質(zhì)量評(píng)價(jià)與質(zhì)量管理

ELISA 試劑的評(píng)價(jià)（evaluation ）分兩個(gè)方面：一是試劑本身的質(zhì)量評(píng)價(jià)，符合一定要求后才能生產(chǎn)供應(yīng)；一是在臨床應(yīng)用中效果的評(píng)價(jià)。以肝炎ELISA 診斷試劑為例，首先必須通過中國(guó)藥品生物制品檢定，以得到生產(chǎn)的許可。檢定內(nèi)容除包裝、標(biāo)簽、說明書等外，對(duì)試劑的性能，如特異性、靈敏度、精密度和線性等均需逐項(xiàng)檢定，通過對(duì)一系列參比品的檢測(cè)，結(jié)果符合要求者才為合格。ELISA 試劑的臨床質(zhì)量評(píng)價(jià)是用該試劑對(duì)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，以觀察其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。部臨檢中心對(duì)乙肝ELISA 診斷試劑在這方面進(jìn)行了工作，通過質(zhì)量評(píng)價(jià)，促進(jìn)了試劑質(zhì)量的提高。

一、診斷試劑臨床質(zhì)量評(píng)價(jià)要點(diǎn)
從臨床應(yīng)用角度考核檢驗(yàn)試劑的可靠性，是以其能否區(qū)分健康與疾病的能力作為依據(jù)的。目前還很難找到 100%可靠的試驗(yàn)，任何試驗(yàn)都會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性。判斷試驗(yàn)的可靠性常以其靈敏度及特異性作為考核標(biāo)準(zhǔn)。臨床應(yīng)用的靈敏度用疾病患者試驗(yàn)陽(yáng)性的百分率表示，特異性以無病者試驗(yàn)陰性的百分率表示。
進(jìn)行這種評(píng)價(jià)，首先需要收集有關(guān)的病人血清，然后用公認(rèn)的檢測(cè)該項(xiàng)標(biāo)志物最可靠的試劑進(jìn)行測(cè)定，以確定其為陽(yáng)性或陰性。這一組表明測(cè)定物為陽(yáng)性或陰性的血清組成"血清盤"（panel）。被評(píng)價(jià)的試劑測(cè)定此血清所得結(jié)果與血清盤標(biāo)明的結(jié)果的關(guān)系如下表：
血清盤結(jié)果
合計(jì)

一般認(rèn)為靈敏度或特異性>90%為良好。符合率是綜合靈敏度和特異性的指標(biāo)。

二、 臨床考核血清盤的制備要求
1、采用人的原血清；
2、血清盤應(yīng)具有相應(yīng)的穩(wěn)定性；
3、血清盤中樣本不含防腐劑，或只含極微量的、不影響檢驗(yàn)結(jié)果的防腐劑；
4、血清盤所包含的陰性樣本和陽(yáng)性樣本約各占一半；
5、陽(yáng)性樣本中，應(yīng)有一定數(shù)量的強(qiáng)陽(yáng)性和弱陽(yáng)性樣本；
6、血清盤中應(yīng)有一定數(shù)量的臨界值上、下含量的樣品，以檢驗(yàn)試劑的靈敏度。
7、血清盤中應(yīng)包含與該項(xiàng)檢驗(yàn)相關(guān)的病種樣本和已積知具有干擾物質(zhì)（RF 因子）的樣本，以檢驗(yàn)試劑的特異性。

6.3 臨床考核血清盤的建議
以抗 -HBc-IgM 為例，部臨檢中心收集近百例臨床肝炎病人的樣本，經(jīng)美國(guó)abbott 公司抗-HBc-IgM 試劑反復(fù)檢驗(yàn)篩選。選出血清70 份，其中陽(yáng)性29 份，陰性41 份，組成抗-HBc-IgM 臨床考核血清盤。在70 份樣本中，除7 份為無病歷的質(zhì)控血清外，抗-HBc-IgM 陽(yáng)性的22 份樣本中含臨床診斷急性肝炎16 例、慢性活動(dòng)性肝炎5 例、重癥肝炎1 例；抗-HBc-IgM 陰性的40 份樣本中，含臨床診斷慢性遷延性肝炎24 例、急性肝炎例（均為恢復(fù)期采的血樣）、慢性活動(dòng)性肝炎8 例（其中5 例為恢復(fù)血樣）。
因此，這套抗血清盤用于商品試劑的臨床考核，可以將臨床上乙肝急性期、慢性活動(dòng)期病人區(qū)分開，具有臨床診斷意義。



質(zhì)量管理
ELISA 是一種敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷方法，由于其試劑穩(wěn)定、易保存、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果判斷較客觀等因素，以及既適宜于大規(guī)模篩查試驗(yàn)又可以用于少量標(biāo)本的檢測(cè)，既可以做定性試驗(yàn)也可以做定量分析等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)、腫瘤學(xué)和細(xì)胞因子等領(lǐng)域。ELISA 的影響因素較多，加強(qiáng)質(zhì)量管理才能充分發(fā)揮其方法學(xué)的優(yōu)點(diǎn)。

分析前質(zhì)控
●人員培訓(xùn)實(shí)驗(yàn)是人操作的，因此檢驗(yàn)人員需經(jīng)過培訓(xùn)，熟練掌握本專業(yè)如下幾方面的技術(shù)知識(shí)：
◎檢驗(yàn)項(xiàng)目的基本原理（ELISA 原理）；
◎臨床意義；
◎熟悉檢測(cè)技巧，了解易出差錯(cuò)的環(huán)節(jié)及難點(diǎn)；
◎熟悉檢測(cè)試劑性能（包括試劑盒組成，包被片段及其組成）；
◎ 熟悉檢測(cè)儀器的原理及性能；掌握數(shù)據(jù)處理的能力和質(zhì)量控制知識(shí)。
◎某些特殊項(xiàng)目的檢測(cè)如抗HIV 等需經(jīng)有關(guān)部門組織的專門培訓(xùn)班，考試合格后持證上崗。
分析前質(zhì)控
◎ELISA 原理：1971 年Engvall 等人把免疫組化的EIA 技術(shù)應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)發(fā)展為ELISA 技術(shù)。
特點(diǎn)：在固相表面組裝免疫活性物質(zhì)形成"免疫吸附劑"
酶標(biāo)記免疫活性物質(zhì)，進(jìn)行信號(hào)放大；
有二步溫育反應(yīng)二次洗滌過程；
靈敏度特異性相對(duì)較高。
局限性：只能檢測(cè)到ng 水平
精密度差（批內(nèi)CV15-20%）；
線性范圍窄（一個(gè)數(shù)量級(jí)）；
存在"HD-HOOK" 效應(yīng)。
ELISA 原理

●根據(jù)檢測(cè)目的和操作步驟不同有三種基本方法。
●雙抗體（原）夾心法檢測(cè)抗原（體）的常見方法，應(yīng)用針對(duì)抗原兩個(gè)不同決定族的兩種單抗分別作為固相載體和酶標(biāo)抗體檢測(cè)溶液中的抗原（適用于二價(jià)以上抗原,不能測(cè)小分子半抗原）。
●間接法檢測(cè)抗體的方法，利用酶標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）檢測(cè)已與固相抗原結(jié)合的抗體。
●競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)抗原或小分子半抗原、抗體，以測(cè)抗原為例，使待測(cè)抗原和酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合，結(jié)果如待測(cè)抗原含量越多，與固相抗體結(jié)合的酶標(biāo)抗原就越少，顯色越淺，二者呈負(fù)相關(guān)。
ELISA 今后的發(fā)展方向

●聚苯乙烯表面的高級(jí)制備。已有的技術(shù)是酰肼化（聚二氟乙叉，PVDF）；生物素化；預(yù)包被多聚賴氨酸等，均是專利產(chǎn)品。
●酶促信號(hào)放大的改變，如酶促熒光、酶促化學(xué)發(fā)光等。
ELISA 臨床意義
●各型肝炎的特征及標(biāo)志物
乙肝二對(duì)半的模式及臨床意義
HBsAg HBeAg HBcAb-IgG HBcAg-IgM HBeAb HBsAb &n bsp; 臨床意義
---- 急性HBV 感染早期HBV 復(fù)制活躍
-- 急慢性HBV 感染，HBV 復(fù)制活躍
- -- 急慢性HBV 感染，HBV 復(fù)制中躍
- - 急慢性HBV 感染，HBV 復(fù)制低躍
- - -HBV 復(fù)制停止或極低
-- -- 平靜的HBV 攜帶狀態(tài)，HbsAg
-- ---HBV 既往感染，未產(chǎn)生抗-HBs
-- -抗HBs 出現(xiàn)前期，HBV 復(fù)制低
-- - HBV 感染恢復(fù)期
-- -- HBV 感染恢復(fù)期
- 不同亞型ＨＢＶ再感染
-----ＨＢＶ－ＤＮＡ整合
-----＋ 病后或接種疫苗后獲得免疫



試劑盒選擇

◎衛(wèi)生部規(guī)定乙肝試劑，丙肝試劑，艾滋病試劑，梅毒試劑及血型試劑必須使用經(jīng)衛(wèi)生部生物制品檢定所檢定合格，并貼有防偽標(biāo)簽的產(chǎn)品，試劑應(yīng)從靈敏度，特異性，精密度，穩(wěn)定性，簡(jiǎn)便性，安全性及經(jīng)濟(jì)性作出全面的評(píng)價(jià)。
◎靈敏度：有二層含義，1）為試劑檢出被檢物質(zhì)的最低量的能力；2）為試劑對(duì)人群或大量樣品中陽(yáng)性檢出的能力（假陰性越少越好），取決于包被物的全面性。