實(shí)驗(yàn)常用試劑的制備與儲(chǔ)藏

實(shí)驗(yàn)常用試劑的制備與儲(chǔ)藏
作者：佚名 來源：生物秀 時(shí)間：2007-10-12
  一.常用貯液與溶液
  1mol/L亞精胺（Spermidine）: 溶解2.55g亞精胺于足量的水中，使終體積為10ml。分裝成小份貯存于-20℃。
  1mol/L精胺（Spermine）：溶解3.48g精胺于足量的水中，使終體積為10ml。分裝成小份貯存于-20℃。
  10mol/L乙酸胺（ammonium acetate）：將77.1g乙酸胺溶解于水中，加水定容至1L后，用0.22um孔徑的濾膜過濾除菌。
  10mg/ml牛血清蛋白(BSA）：加100mg的牛血清蛋白（組分V或分子生物學(xué)試劑級，無DNA酶）于9.5ml水中（為減少變性，
  須將蛋白加入水中，而不是將水加入蛋白），蓋好蓋后，輕輕搖動(dòng)，直至牛血清蛋白完全溶解為止。不要渦旋混合。加水定容到10ml，然后分裝成小份貯存于-20℃。
  1mol/L二硫蘇糖醇（DTT）：在二硫蘇糖醇5g的原裝瓶中加32.4ml水，分成小份貯存于-20℃�；蜣D(zhuǎn)移100mg的二硫蘇糖醇
  至微量離心管，加0.65ml的水配制成1mol/L二硫蘇糖醇溶液。
  8mol/L乙酸鉀（potassium acetate）：溶解78.5g乙酸鉀于足量的水中，加水定容到100ml。
  1mol/L氯化鉀（KCl）：溶解7.46g氯化鉀于足量的水中，加水定容到100ml。
  3mol/L乙酸鈉（sodium acetate）：溶解40.8g的三水乙酸鈉于約90ml水中，用冰乙酸調(diào)溶液的pH至5.2，再加水定容到100ml。
  0.5mol/L
  EDTA:配制等摩爾的Na2EDTA和NaOH溶液（0.5mol/L），混合后形成EDTA的三鈉鹽。或稱取186.1g的Na2EDTA·2H2O和20g的NaOH，并溶于水中，定容至1L。
  1mol/L HEPES：將23.8gHEPES溶于約90ml的水中，用NaOH調(diào)pH（6.8-8.2），然后用水定容至100ml。
  1mol/L HCl：加8.6ml的濃鹽酸至91.4ml的水中。
  25mg/ml IPGT：溶解250mg的IPGT（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）于10ml水中，分成小份貯存于-20℃。
  1mol/LMgCl2:溶解20.3g MgCl2·6H2O于足量的水中，定容到100ml。
  100mmol/L PMSF：溶解174mg的PMSF（苯甲基磺酰氟）于足量的異丙醇中，定容到10ml。分成小份并用鋁箔將裝液管包裹
  或貯存于-20℃。
  20mg/ml蛋白酶K（proteinase
  K）：將200mg的蛋白酶L加入到9.5ml水中，輕輕搖動(dòng)，直至蛋白酶K完全溶解。不要渦旋混合。加水定容到10ml，然后分裝成小份貯存于-20℃。
  10mg/mlRnase（無DNase）（DNase－free RNase）：溶解10mg的胰蛋白RNA酶于1ml的10mmol/L的乙酸鈉水溶液中（pH
  5.0）。溶解后于水浴中煮沸15min，使DNA酶失活。用1mol/L的Tris－HCl調(diào)pH至7.5，于-20℃貯存。（配制過程中要戴手套）
  5mol/L氯化鈉（NaCl）：溶解29.2g氯化鈉于足量的水中，定容至100ml。
  10N氫氧化鈉（NaOH）：溶解400g氫氧化鈉顆粒于約0.9L水的燒杯中（磁力攪拌器攪拌），氫氧化鈉完全溶解后用水定容至1L。
  10％SDS（十二烷基硫酸鈉）：稱取100gSDS慢慢轉(zhuǎn)移到約含0.9L的水的燒杯中，用磁力攪拌器攪拌直至完全溶解。用水定容至1L。

2mol/L山梨（糖）醇（Sorbitol）：溶解36.4g山梨（糖）醇于足量水中使終體積為100ml。
  100％三氯乙酸（TCA）:在裝有500gTCA的試劑瓶中加入100ml水，用磁力攪拌器攪拌直至完全溶解。（稀釋液應(yīng)在臨用前配制）
  2.5％ X－gal（5-溴-4-氯-3-吲哚－β-半乳糖苷）：溶解25mg的X－gal于1ml的二甲基甲酰胺（DMF）,用鋁箔包裹裝液管，貯存于-20℃。
  100×Denhardt試劑（Denhardt's regent）
    

 

 

 

 

依照上表稱取各組分，溶于水中定容。過濾除菌及雜質(zhì)，分裝成小份于-20℃貯存。
  10×標(biāo)準(zhǔn)DNA連接酶緩沖液（standard DNA ligase buffer）（粘端、平端連接）

 

 

 

 

 

 

 

將配制好的緩沖液分裝成小份，貯存于-20℃ 。
  100 mmol/L dNTP 溶液（dNTP solutions）
  可以購買到100mmol/L純dNTPs貯液，-80℃可貯存至少6個(gè)月。
  10mmol/L dNTP混合液

 

 

 

 

 

 

20％PEG 8000/2.5M NaCl

 

 

 

 

加聚乙二醇于含有氯化鈉的燒杯中，加水至終體積100ml，用磁力攪拌器攪拌溶解。
  20×SSC

 

 

 

 

溶解檸檬酸三鈉（二水）和氯化鈉于約0.9L水中，加幾滴10N NaOH溶液調(diào)pH為7.0，用水補(bǔ)足體積至1L。
  DEPC（焦碳酸二乙酯）處理水
  加100ul DEPC 于 100ml 水中，使DEPC的體積分?jǐn)?shù)為0.1％。在37℃溫浴至少12h，然后在15 psi
  條件下高壓滅菌20min，以使殘余的DEPC失活。DEPC會(huì)與胺起反應(yīng)，不可用DEPC處理Tris緩沖液。
  甲酰胺（deionized formamide）
  直接購買或加Dowex XG8 混合樹脂于裝有甲酰胺的玻璃燒杯中，用磁力攪拌器輕輕攪拌1h，可去除甲酰胺中的離子。經(jīng)Whatman
  1號濾紙過濾除去樹脂后分成小份，充氮?dú)庥?80℃貯存（防止氧化）。
  磷酸緩沖液（phosphate buffer）
  按照下表所給定的體積，混合1 mol/L 的磷酸二氫鈉（單堿）和1mol/L 磷酸氫二鈉（雙堿）貯液，獲得所需pH的磷酸緩沖液。配制1 mol/L
  的磷酸二氫鈉（NaH2PO4·H2O）貯液：溶解138g于足量水中，使終體積為1L;1mol/L
  磷酸氫二鈉（Na2HPO4）貯液:溶解142g于足量水中使終體積為1L。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

TE（用于懸浮和貯存DNA）

 

 

 

 

Tris緩沖液（Tris-HCl buffer）
  將121g的Tris堿溶解于約0.9L水中，再根據(jù)所要求的pH（25℃下）加一定量的濃鹽酸（11.6N），用水調(diào)整終體積至1L。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

二.電泳緩沖液、染料和凝膠加樣液
  電泳緩沖液
  50×Tris-乙酸（TAE）緩沖液

 

 

 

 

 

5×Tris-硼酸（TBE）緩沖液

 

 

 

 

染料
  1％溴酚藍(lán)（bromophenol blue）
  加1g水溶性鈉型溴酚藍(lán)于100ml水中，攪拌或渦旋混合直到完全溶解。
  1％二甲苯青FF（xylene cyanole FF）
  溶解1g二甲苯青FF于足量水中，定容到100ml。
  10mg/ml的溴化乙錠（ethidium bromide）
  小心稱取1g溴化乙錠，轉(zhuǎn)移到廣口瓶中，加100ml水，用磁力攪拌器攪拌直到完全溶解。用鋁箔包裹裝液管，于4℃貯存。
  凝膠上樣液（gel loading solutions）
  6×堿性凝膠上樣液（室溫貯存）

 

 

 

 

 

 

6×聚蔗糖凝膠上樣液（室溫貯存）

 

 

 

 

 

6×溴酚藍(lán)/二甲苯青/聚蔗糖凝膠上樣液（室溫貯存）

 

 

 

 

6×甘油凝膠上樣液（4℃貯存）

 

 

 

 

 

 

6×蔗糖凝膠上樣液（室溫貯存）

 

 

 

 

 

10×十二烷基硫酸鈉/甘油凝膠上樣液（室溫貯存）

 

 

 

 

 

 

三.常用培養(yǎng)基
  LB培養(yǎng)基
  將下列組分溶解在0.9L水中：

 

 

 

 

如果需要用1N NaOH（～1ml）調(diào)整pH至7.0，再補(bǔ)足水至1L。注：瓊脂平板需添加瓊脂粉12g/L,上層瓊脂平板添加瓊脂粉7g/L。
  SOB培養(yǎng)基
  將下列組分溶解在0.9L水中：

 

 

 

 

 

 用水補(bǔ)足體積到1L。分成100ml的小份，高壓滅菌。培養(yǎng)基冷卻到室溫后，再在每100ml的小份中加1ml滅過菌的1mol/L氯化鎂。
  SOC培養(yǎng)基
  成分、方法同SOB培養(yǎng)基的配制，只是在培養(yǎng)基冷卻到室溫后，除了在每100ml的小份中加1ml滅過菌的1mol/L氯化鎂外，再加2ml滅菌的1mol/L葡萄糖（18g葡萄糖溶于足夠水中，再用水補(bǔ)足到100ml，用0.22um的濾膜過濾除菌）。
  TB培養(yǎng)基
  將下列組分溶解在0.9L水中：

 

 

 

 

 

各組分溶解后高壓滅菌。冷卻到60℃，再加100ml滅菌的170mmol/L KH2PO4/0.72 mol/L
  K2HPO4的溶液（2.31g的KH2PO4和12.54gK2HPO4溶在足量的水中，使終體積為100ml。高壓滅菌或用0.22um的濾膜過濾除菌）。
  2×YT培養(yǎng)基
  將下列組分溶解在0.9L水中：

 

 

 

 

如果需要用1N NaOH（～1ml）調(diào)整pH至7.0，再補(bǔ)足水至1L。注：瓊脂平板需添加瓊脂粉12g/L,上層瓊脂平板添加瓊脂粉7g/L。
  YPD培養(yǎng)基
  將下列組分溶解在0.9L水中：

 

 

 

 

用水補(bǔ)足體積為1L后，高壓滅菌。建議在高壓滅菌之前，對色氨酸營養(yǎng)缺陷型每升培養(yǎng)基添加1.6g色氨酸，因?yàn)閅PD培養(yǎng)基是色氨酸限制型培養(yǎng)基。為了配制平板，需要在高壓滅菌前加入20g瓊脂粉。
  四.常用抗生素
  氨芐青霉素（ampicillin）（100mg/ml）
  溶解1g氨芐青霉素鈉鹽于足量的水中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20℃貯存。常以25ug/ml～50ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基。
  羧芐青霉素（carbenicillin）（50mg/ml）
  溶解0.5g羧芐青霉素二鈉鹽于足量的水中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20℃貯存。常以25ug/ml～50ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基。
  甲氧西林（methicillin）（100mg/ml）
  溶解1g甲氧西林鈉于足量的水中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20℃貯存。常以37.5ug/ml終濃度與100ug/ml氨芐青霉素一起添加于生長培養(yǎng)基。
  卡那霉素（kanamycin）（10mg/ml）
  溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20℃貯存。常以10ug/ml～50ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基。
  氯霉素（chloramphenicol）（25mg/ml）
  溶解250mg氯霉素足量的無水乙醇中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20℃貯存。常以12.5ug/ml～25ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基。
  鏈霉素（streptomycin）（50mg/ml）
  溶解0.5g鏈霉素硫酸鹽于足量的無水乙醇中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20℃貯存。常以10ug/ml～50ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基。
  萘啶酮酸（nalidixic acid）（5mg/ml）
  溶解50mg萘啶酮酸鈉鹽于足量的水中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20℃貯存。常以15ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基。
  四環(huán)素（tetracyyline）（10mg/ml）
  溶解100mg四環(huán)素鹽酸鹽于足量的水中，或者將無堿的四環(huán)素溶于無水乙醇，定容至10ml。分裝成小份用鋁箔包裹裝液管以免溶液見光，于-20℃貯存。常以10ug/ml～50ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基。