相差顯微鏡使用方法
相差顯微鏡是荷蘭科學家Zermike于1935年發(fā)明的，用于觀察未染色標本的顯微鏡�；罴毎臀慈旧纳飿吮�，因細胞各部細微結(jié)構(gòu)的折射率和厚度的不同，光波通過時，波長和振幅并不發(fā)生變化，僅相位發(fā)生變化(振幅差)，這種振幅差人眼無法觀察。而相差顯微鏡通過改變這種相位差，并利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相差變?yōu)檎穹顏碛^察活細胞和未染色的標本。相差顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別是:用環(huán)狀光闌代替可變光闌， 用帶相板的物鏡代替普通物鏡，并帶有一個合軸用的望遠鏡。
相差顯微鏡具有兩個其他顯微鏡所不具有的功能:①將直射的光(視野中背景光)與經(jīng)物體衍射的光分開;②將大約一半的波長從相位中除去，使之不能發(fā)生相互作用，從而引起強度的變化。
相差顯微鏡（phasecontrast microscope）由P．Zernike于1935年發(fā)明，并因此獲1953年諾貝爾物理獎。這種顯微鏡最大的特點是可以觀察未經(jīng)染色的標本和活細胞。
相差顯微鏡使用中的幾個問題：
（1）相位倒轉(zhuǎn) 當n’<n或n’>n時得到象的明暗反差正好相反，稱為相位倒轉(zhuǎn)。當相位差δ=0時是無法識別的，隨著δ的增大反差變大，當δ繼續(xù)增大到某一值后會出現(xiàn)相位倒轉(zhuǎn)。用90%高吸光值（高反差）物鏡時，這個轉(zhuǎn)變值約為0.55λ，用70%標準吸光值的物鏡時約為0.33λ。較高吸光值的物鏡應(yīng)該用于分辨較小的光程差。
（2）暈輪和漸暗效應(yīng) 在相差顯微鏡成象過程中，某一結(jié)構(gòu)由于相位的延遲而變暗時，并不是光的損失，而是光在象平面上重新分配的結(jié)果。因此在黑暗區(qū)域明顯消失的光會在較暗物體的周圍出現(xiàn)一個明亮的暈輪。這是相差顯微鏡的缺點，它妨礙了精細結(jié)構(gòu)的觀察，當環(huán)狀光闌很窄時暈輪現(xiàn)象更為嚴重。相差顯微鏡的另一個現(xiàn)象是漸暗效應(yīng)，指相差觀察相位延遲相同的較大區(qū)域時，該區(qū)域邊緣會出現(xiàn)反差下降。
（3）樣品厚度的影響 當進行相差觀察時，樣品的厚度應(yīng)該為5μm或者更薄，當采用較厚的樣品時，樣品的上層是很清楚的，深層則會模糊不清并且會產(chǎn)生相位移干擾及光的散射干擾。
（4）蓋玻片和載玻片的影響 樣品一定要蓋上蓋上蓋玻片，否則環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的暗環(huán)很難重合。相差觀察對載玻片和蓋玻片的玻璃質(zhì)量也有較高的要求，當有劃痕，厚薄不均或凹凸不平時會產(chǎn)生亮環(huán)歪斜及相位干擾。另外玻片過厚或過薄時會使環(huán)狀光闌亮環(huán)變大或變小。
