漢莎快訊（三）:葉綠素熒光—光合作用研究和光能分配的探針
漢莎快訊：光合作用研究系列文章：
葉綠素熒光—光合作用研究和光能分配的探針（基礎(chǔ)理論篇）
Kautsky和Hirsh（1931）最先認識到光合原初反應和葉綠素熒光存在著密切關(guān)系。他們第一次報告了經(jīng)過暗適應的光合材料照光后，葉綠素熒光先迅速上升到一個最大值，然后逐漸下降，最后達到一個穩(wěn)定值。此后，隨著研究的深入，人們逐步認識到熒光誘導動力學曲線中蘊藏著豐富的信息。
No investigation into the photosynthetic performance of plants under field conditions seems complete without some fluorescence data. ------- Giles N.Johnson
葉綠素熒光動力學包含著光合作用過程的重要信息，如光能的吸收和轉(zhuǎn)化。能量的傳遞與分配、反應中心的狀態(tài)，過剩能量的耗散以及反映光合作用的光抑制和光破壞。應用葉綠素熒光可以對植物材料進行原位、無損傷的檢測，且操作步驟簡單。所以葉綠素熒光越來越受到人們的青睞，在光合生理和逆境生理等研究領(lǐng)域有著廣泛的應用。
葉綠素熒光產(chǎn)生的基本原理：
葉綠素分子吸收光能（激發(fā)能）后，由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定的狀態(tài)，就會再回到基態(tài)，電子由基態(tài)回到基態(tài)的過程中，大部分能量轉(zhuǎn)向反應中心推動光化學反應及后來的電子傳遞光合磷酸化，固定。還原CO2最終將能量貯存在有機物中，一小部分能量以熱的形式耗散，再有一部分能量以熒光的形式發(fā)出。這三者之間是此消彼長相互競爭的關(guān)系。因此我們可以用葉綠素熒光來研究光合作用的變化。
植物體內(nèi)的葉綠素熒光誘導動力學曲線的測定可采用脈沖調(diào)制式熒光儀和連續(xù)激發(fā)式（非調(diào)制式）熒光儀兩種不同的方法，它們各有不同的特點。
脈沖調(diào)制式熒光儀：
由于調(diào)制式熒光儀用來測量熒光的光源是調(diào)制脈沖光（高頻率的閃光），植物發(fā)出的熒光信號與儀器光源發(fā)出的光可以區(qū)分開，所以用它可以在有背景光的情況下測定。常用的做法是，調(diào)制式熒光儀的測量步驟是，先打開測量光（measuring light），測暗適應葉片的最小熒光（FO），然后打開飽和脈沖光（saturating flash light）測暗適應葉片的最大熒光（FM），然后再開啟作用光（actinic light）使所測材料受光而進行光合作用。當所測材料光適應后，開啟測量光測光適應葉片的穩(wěn)態(tài)熒光（FS），然后打開飽和脈沖光測光適應后的最大熒光（FM’），關(guān)掉作用光，打開遠紅光（far-red light）優(yōu)先激發(fā)PSⅠ使PSⅡ電子傳遞體處于氧化狀態(tài)，測定光適應葉片的最小熒光（FO’）（圖2）。根據(jù)這些變數(shù)可以計算暗適應下PSⅡ的最大量子產(chǎn)額[FV/FM=(FM-FO)/FM]、光適應下PSⅡ的最大量子產(chǎn)額[FV’/FM’= (FM’-FO’)/FM’]、光適應下的PSⅡ反應中心開放的比例[qP=(FM’-FS)/( FM’-FO’)]、光適應下PSⅡ的實際光化學效率[ΦPSII=(FM’-FS)/FM’]（Genty等 1989）、光適應下的非光化學猝滅[NPQ=FM/FM’-1]（Demmig-Adams和Adams 1996）等。這些參數(shù)除了FV/FM反映了熒光誘導動力學曲線上升過程的O-P段外，其它都是反映P點之后的下降過程。由于光合作用的碳同化反應能反饋影響光合原初反應，調(diào)制式熒光儀主要通過測量光合作用的原初光化學反應的情況來反映光合作用的碳同化等反映啟動后的光能捕獲、轉(zhuǎn)化及利用情況。而對于碳同化反應活化前PSⅡ的光化學變化，所獲得的信息就很少了。由于時間分辨率及信噪比的限制，對于從O-P上升過程中熒光變化的信息量的獲得，與連續(xù)激發(fā)式熒光儀相比，調(diào)制式熒光儀遠不及前者。
連續(xù)激發(fā)式熒光儀：
連續(xù)激發(fā)式熒光儀（PEA或Handy PEA，Hansatech，英國）主要是通過短時間照光后熒光信號的瞬時變化反映暗反應活化前PSⅡ的光化學變化，它具有相當高的分辨率（初始記錄速度為每秒鐘10萬次，即100kHz），所以能夠從O-P上升過程中捕捉到更多的熒光變化信息，如O-P變化過程中的另外兩個拐點（J點和I點）。從10μs最長到300s（Handy-PEA）內(nèi)不同時間的熒光信號都能被按時記錄。在對快速葉綠素熒光誘導動力學曲線作圖時，為了更好地觀察J點和I點，一般把代表時間的橫坐標改為用對數(shù)坐標，使呈現(xiàn)出O-J-I-P誘導曲線（圖3B）。與調(diào)制式熒光儀相比，連續(xù)激發(fā)式熒光儀有以下很多優(yōu)點：獲得信息量大、操作簡便快捷、測定易于多次重復；儀器便于攜帶、存儲量大、價格低廉。
圖2 用脈沖調(diào)制式熒光儀測定熒光參數(shù)的葉綠素熒光動力學曲線
（注：引自許大全著《光合作用效率》2002）
參考文獻：
Genty B, Briantais JM, Baker NR (1989). The relationship between the quantum yield of photosynthetic electron transport and quenching of chlorophyll fluorescence. Biochim Biophys Acta, 990: 87-92
Demmig-Adams B, Adams WWIII (1996). Xanthophyll cycle and light stress in nature: uniform response to excess direct sunlight among higher plant species. Planta, 198: 460-470
李鵬民, 高輝遠, Strasser R J. 快速葉綠素熒光誘導動力學分析在光合作用研究中的應用. 植物生理與分子生物學學報, 2005, 31(6): 559-566
Li PM, Gao HY, Strasser RJ. Application of the chlorophyll fluorescence Induction dynamics in photosynthesis study. Journal of Plant Physiology and Molecular Biology, 2005, 31(6): 559-566
許大全. 光合作用效率. 上海: 上�？茖W技術(shù)出版社, 2002
