膜片鉗技術(shù)原理

      細(xì)胞膜由脂類雙分子層和和蛋白質(zhì)構(gòu)成。脂質(zhì)層的電導(dǎo)很低，由于雙分子層的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，形成了細(xì)胞的膜電容，通道蛋白的開(kāi)閉狀況主要決定了膜電導(dǎo)的數(shù)值。在細(xì)胞膜的電學(xué)模型中，膜電容和膜電導(dǎo)構(gòu)成了一個(gè)并聯(lián)回路。在細(xì)胞膜的電興奮過(guò)程中，脂質(zhì)層膜電容的反應(yīng)是被動(dòng)的，其電流電壓曲線是線性的；而由通道蛋白介導(dǎo)的膜電導(dǎo)構(gòu)成了膜反應(yīng)的主動(dòng)成分，它的電流電壓關(guān)系是非線性的。

當(dāng)改變跨膜電位時(shí)，膜電容和膜電導(dǎo)分別引發(fā)被動(dòng)和主動(dòng)電流：Im=Ii＋CdV/dt，其中Im是流過(guò)膜的總電流，Ii是通道電流，CdV/dt是由膜電容介導(dǎo)的電容電流。為了考察通道電流就必須消除電容電流的影響，此時(shí)可以令dV/dt＝0，即將膜電位鉗制在一固定數(shù)值，使其不隨時(shí)間變化，這就是電壓鉗技術(shù)的實(shí)質(zhì)所在。

 

 

     離子通道的近代觀念源于Hodgkin、Huxley、Katz等人在20世紀(jì)30—50年代的開(kāi)創(chuàng)性研究。在1902年，Bernstein創(chuàng)造性地將Nernst的理論應(yīng)用到生物膜上，提出了“膜學(xué)說(shuō)”。他認(rèn)為在靜息狀態(tài)下，細(xì)胞膜只對(duì)鉀離子具有通透性；而當(dāng)細(xì)胞興奮的瞬間，膜的破裂使其喪失了選擇通透性，所有的離子都可以自由通過(guò)。Cole等人在1939年進(jìn)行的高頻交變電流測(cè)量實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)動(dòng)作電位被觸發(fā)時(shí)，雖然細(xì)胞的膜電導(dǎo)大為增加，但膜電容卻只略有下降，這個(gè)事實(shí)表明膜學(xué)說(shuō)所宣稱的膜破裂的觀點(diǎn)是不可靠的。1949年Cole在玻璃微電極技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)明了電壓鉗位（voltage clamp technique）技術(shù)，基本原理如下：

     

 

      電壓鉗技術(shù)的核心在于將膜電位固定在指令電壓的水平，這樣才能研究在給定膜電位下膜電流隨時(shí)間的變化關(guān)系。在上圖中，膜電位Vm由高輸入阻抗的電壓跟隨器所測(cè)量。鉗制放大器在比較了膜電位和指令電位E之后，通過(guò)電阻Ra將電流注入膜內(nèi)以控制膜電位。鉗制放大器的輸出：Vo=A（E－Vm），因?yàn)檫@個(gè)輸出由電阻Ra和膜所分壓，所以輸出電流：I=（Vo－Vm）/Ra。由這兩個(gè)關(guān)系可推出：Vm=EA/(1+A)-RaI/（1+A）。因此若鉗制放大器的增益A極大，膜電位Vm和指令電位E之間的差別就可以忽略，即實(shí)現(xiàn)了電壓鉗制。

     Hodgkin、Huxley和Katz應(yīng)用電壓鉗技術(shù)研究槍烏賊巨軸突，結(jié)合同位素示蹤和胞內(nèi)灌流等技術(shù)發(fā)現(xiàn)：動(dòng)作電位的初期，細(xì)胞膜主要對(duì)鈉離子的通透性發(fā)生改變，胞外的鈉離子迅速內(nèi)流，并產(chǎn)生所謂的“超射”現(xiàn)象（overshoot）；隨后對(duì)鈉的通透性的急劇減少并且對(duì)鉀離子的通透性增加。興奮期的膜電位存在“超射”現(xiàn)象也是膜學(xué)說(shuō)所不能解釋的。

     根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)，Hodgkin、Huxley和Katz在其1949—1952年的一系列論文中提出了“離子學(xué)說(shuō)”或“鈉學(xué)說(shuō)”。認(rèn)為當(dāng)膜的去極化超過(guò)一個(gè)臨界值時(shí)，就會(huì)觸發(fā)動(dòng)作電位的產(chǎn)生。在此期間，鈉電導(dǎo)迅速上升，鈉離子大量?jī)?nèi)流，使得膜電位接近鈉的平衡電位；隨后鈉電導(dǎo)迅速失活，鉀電導(dǎo)逐漸增加，引起膜電位的復(fù)極化。

    Hodgkin和Huxley通過(guò)對(duì)電壓鉗位實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，給出了所謂的Hodgkin—Huxley方程。他們將膜電位鉗制在不同的水平，觀察鉀電導(dǎo)或鈉電導(dǎo)隨時(shí)間的變化，然后用一個(gè)常微分方程去逼近所得到的實(shí)驗(yàn)曲線，而這些微分方程中的參數(shù)則假定跟離子通道上的“粒子”相關(guān)。根據(jù)H—H方程，能夠推導(dǎo)出動(dòng)作電位的閾值、形狀、幅度等性質(zhì)。并且在去除電壓鉗制的條件下，可以得到一個(gè)以電壓和時(shí)間為變量的偏微分方程，由它可以給出和真實(shí)狀況相符合的神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)。

 

 

     Katz等人在1970年代初期研究了蛙神經(jīng)肌肉接頭處肌纖維膜電位的波動(dòng)。他們根據(jù)對(duì)這種膜電位“噪聲”的分析，提出了量子釋放的概念，認(rèn)為神經(jīng)遞質(zhì)是以囊泡的形式從突觸前膜釋放到突觸間隙中。并且Katz等人借助這種新的“噪聲分析”方法（fluctuation analysis），能從突觸后膜電位的“噪聲”中推測(cè)出單位事件的幅度和時(shí)程。Anderson、Stevens、Colquhoun和Sigworth等人進(jìn)一步發(fā)展了“噪聲分析”。

     “噪聲分析”的實(shí)質(zhì)在于二項(xiàng)分布期望和方差之間的關(guān)系。假定通道只有開(kāi)和關(guān)兩個(gè)狀態(tài)，并且各個(gè)通道的開(kāi)關(guān)是獨(dú)立的。若N是通道的總數(shù)，p是通道的開(kāi)放概率，i是單通道電流，I是膜電流的期望值。則有：I=Npi，var(I)=Np(1-p)i²,即：var(I)=iI-I²/N。用var(I)對(duì)I作圖，這顯然是一個(gè)開(kāi)口朝下的拋物線。微分這個(gè)二次方程得到曲線的斜率：dvar(I)/dI=i-2I/N,當(dāng)I=0時(shí)的斜率就是單通道電流，根據(jù)鉗制電位和反轉(zhuǎn)電位之間的差就可以算出單通道電導(dǎo)；在拋物線的頂點(diǎn)即當(dāng)：dvar(I)/dI=0時(shí)，I=Ni/2，由此可算出離子通道的總數(shù)。

                                       

 

 

     “噪聲分析”只能推算離子通道的電導(dǎo)和時(shí)間弛豫過(guò)程，而不能直接觀測(cè)通道的門控動(dòng)力學(xué)。1976年德國(guó)馬普學(xué)會(huì)生物物理化學(xué)研究所（Göttingen）的兩位科學(xué)家，Neher和Sakmann在電壓鉗技術(shù)的基礎(chǔ)上創(chuàng)立了膜片鉗技術(shù)（patch clamp technique）�！澳て�鉗”的本意就是對(duì)小片細(xì)胞膜進(jìn)行電壓鉗位，然后觀測(cè)通過(guò)這一小塊膜片上單個(gè)離子通道的電流。其電路原理示意圖如下： 

 

    

      膜片鉗技術(shù)的基本原理是通過(guò)負(fù)反饋使得膜電位與指令電壓相等，在電壓鉗制的條件下記錄膜電流。上面是電阻反饋式膜片鉗放大器的電路示意圖。A1為一極高輸入阻抗、極低噪聲的場(chǎng)效應(yīng)管運(yùn)算放大器，由于A1極高的開(kāi)環(huán)增益使得兩個(gè)輸入端的電壓幾乎完全相等，從而實(shí)現(xiàn)電壓鉗制。Rf為一數(shù)值可切換的反饋電阻，分別對(duì)應(yīng)于不同的電流記錄范圍，其中高值反饋電阻具有極高的電阻和極低的雜散電容，是決定放大器單通道記錄性能的基本元件。A2為一差分放大器，它的輸出即為電極電流和反饋電阻的乘積。由放大器A1和A2構(gòu)成的回路稱為電流—電壓轉(zhuǎn)換器，是膜片鉗放大器前級(jí)（headstage）的核心。

      Rs是由電極和細(xì)胞之間的通路所構(gòu)成的串聯(lián)電阻，會(huì)引起全細(xì)胞電壓鉗記錄的點(diǎn)鉗制問(wèn)題，這可通過(guò)Rs Comp回路來(lái)消除。電極入液之后會(huì)產(chǎn)生所謂的“快電容”Cp，即內(nèi)外液相對(duì)于電極壁形成的雜散電容，在形成GΩ封接后變得更明顯。而當(dāng)吸破細(xì)胞膜形成全細(xì)胞模式后，還能觀測(cè)到“慢電容”Cm，即對(duì)于細(xì)胞膜的充放電而產(chǎn)生的電容電流�？梢酝ㄟ^(guò)電容補(bǔ)償回路來(lái)消除這些電容尖峰的影響。由于阻容藕合電路中電阻和電容值的不同，快慢電容的幅度和時(shí)間常數(shù)都不同。對(duì)于有突起的細(xì)胞如腦片中的神經(jīng)元，還存在空間鉗制問(wèn)題，這就難以從電路上消除它的不利影響。

     全細(xì)胞膜片鉗模式下有電壓鉗記錄和電流鉗記錄兩種。電壓鉗記錄的原理與電壓鉗技術(shù)相似，但有所不同：首先，全細(xì)胞電壓鉗記錄只使用單根電極，但在電學(xué)效果上同時(shí)實(shí)現(xiàn)了電壓鉗制和電流記錄。其次，電壓鉗記錄的電極不插進(jìn)細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞造成的損傷較小，因而能用于小細(xì)胞如神經(jīng)元的研究。電流鉗記錄則是通過(guò)鉗制電極電流來(lái)測(cè)量膜電位。電流鉗在本質(zhì)上也是電壓鉗位，它將差分放大器的輸出電流與指令電流相比較，然后將這個(gè)差動(dòng)輸出施加到放大器前級(jí)的倒相端，通過(guò)高速反饋使得同相端的電壓與其相等，無(wú)論電極電流是否為零，都能從輸出電壓得到膜電位的準(zhǔn)確數(shù)值。

      根據(jù)細(xì)胞膜的電路模型，全細(xì)胞模式還可用于監(jiān)測(cè)膜電容的變化。當(dāng)通過(guò)電極給細(xì)胞膜一個(gè)高頻正弦波時(shí)，由于膜電容的存在，膜電阻的反應(yīng)會(huì)有一個(gè)明顯的相位滯后，這個(gè)時(shí)間延遲由膜電容、膜電阻和電極電阻三者決定。當(dāng)后面兩個(gè)因素固定時(shí)，膜電容的變化就會(huì)引起膜電阻反應(yīng)與輸入之間的相位差的變化。對(duì)于各種分泌細(xì)胞：胰島細(xì)胞、腎上腺分泌細(xì)胞或神經(jīng)分泌細(xì)胞，細(xì)胞的分泌伴隨著膜表面積也就是膜電容的變化，可以通過(guò)監(jiān)測(cè)相位差的變化來(lái)觀測(cè)細(xì)胞的分泌過(guò)程。

     單通道記錄的關(guān)鍵在于降低背景噪聲。電阻反饋式放大器存在兩個(gè)問(wèn)題：一是反饋電阻本身的熱噪聲；另一個(gè)是反饋電阻本身的雜散電容。對(duì)于前者，當(dāng)采用大電阻值反饋電阻時(shí)，就能將熱噪聲降低到可以接受的范圍。但反饋電阻的雜散電容與電阻形成一個(gè)低通濾波器，按照現(xiàn)在的工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（50G，0.1pF），這個(gè)濾波器會(huì)使采集到的單通道信號(hào)嚴(yán)重失真。對(duì)于這個(gè)問(wèn)題，可以采用一個(gè)高頻提升器（high frequency boost），信號(hào)經(jīng)過(guò)這樣的處理就會(huì)引入高頻噪聲，因此必須經(jīng)過(guò)低通模擬濾波。

     1976年在封接電阻只有10—20MΩ的情況下，記錄了蛙去神經(jīng)支配的肌纖維膜乙酰膽堿受體的單通道電流，由于背景噪聲的影響，單通道電流矩形脈沖的形狀很不明顯。若要記錄單個(gè)離子通道的微弱電流，就必須將噪聲降低到極小，但按照‘Johnson’公式，由帶電粒子的熱運(yùn)動(dòng)所引起的電流噪聲為：Irms = (4kTfc/R)^1/2，因此就必須極大地提高電阻。因?yàn)榉糯笃鬏斎胱杩�、膜片電阻和反饋電阻都很高，所以必須極大地提高封接電阻。

     后來(lái)發(fā)現(xiàn)當(dāng)略施負(fù)壓之后封接電阻很快上升到了GΩ的范圍，背景噪聲急劇下降，使得高分辨率的單通道記錄變?yōu)榭赡堋ｋS后Hamill和Horn等人將小塊膜片從細(xì)胞膜上分離下來(lái)而不影響封接，這樣就形成了單通道記錄的三種模式：細(xì)胞貼附式、內(nèi)面向外式、外面向外式，連同全細(xì)胞模式于是便有了膜片鉗的四種經(jīng)典記錄模式。Hamill等人在1981年發(fā)表的奠基性論文標(biāo)志著膜片鉗技術(shù)的成熟，隨后在全世界各個(gè)生理學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)和生物物理學(xué)實(shí)驗(yàn)室得到了廣泛的應(yīng)用，極大地推動(dòng)了離子通道和相關(guān)學(xué)科的研究。