原代細胞培養(yǎng)之--培養(yǎng)技術(shù)

原代細胞的培養(yǎng)方法

原代細胞的培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng) 是從供體取得組織細胞在體外進行的首次培養(yǎng)，是建立細胞系的第一步，是一項基本技術(shù)。原代細胞因剛從組織中分離開，生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍保留原來的遺傳特性，也最接近和反映體內(nèi)生長特性，適宜用于藥物敏感性試驗、細胞分化等實驗研究。
原代細胞往往有多種細胞組成，比較混雜，即使從形態(tài)上為同一類型（上皮樣或成纖維樣），但細胞間仍有很大差異。如果供體不同，即使組織類型、部位相同，個體差異也照樣存在，原代細胞生物特性尚不穩(wěn)定，如需做較為嚴格的對比性實驗研究，還需進行短期傳代培養(yǎng)。

1、組織塊培養(yǎng)法
組織塊培養(yǎng)是常用、簡便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法，也是早期采用培養(yǎng)細胞的方法，故原先被稱為組織培養(yǎng)。其方法：為將剪成的小組織團塊接種于培養(yǎng)瓶（或皿）中，瓶壁可預(yù)先涂以膠原薄層，以利于組織塊粘著于瓶壁，使周邊細胞能沿瓶壁向外生長，方法簡便，利于培養(yǎng)，部分種類的組織細胞在小塊貼壁24小時后細胞就從組織塊四周游出，然后逐漸延伸，長成肉眼可以觀察到的生長暈，5~7天后組織塊中央的組織細胞逐漸壞死脫落和發(fā)生漂浮，此漂浮小塊可隨換液而棄去，由組織塊周圍延伸的貼壁細胞也逐漸形成層片，可在顯微鏡下觀察形態(tài)和用于實驗研究。其培養(yǎng)方法如下：
(1)按照前述方法取材，將組織剪成或切成1mm3大小的小塊，并加入少許培養(yǎng)基使組織濕潤。
(2)將小塊均勻涂布于瓶壁，每小塊間距0.2 cm~0.5cm，一般在25mL培養(yǎng)瓶(底面積為17.5cm2)可接種20～30小塊為宜,小塊放置后,輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,使瓶底朝上,然后于瓶內(nèi)加入適量培養(yǎng)基蓋好瓶塞,將瓶傾斜放置在37℃溫箱內(nèi)。
(3)培養(yǎng)2~4小時，待小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放，靜置培養(yǎng)，動作要輕，嚴禁搖動和來回振蕩，以防由于沖動而使小塊漂起而造成培養(yǎng)失敗，若組織塊不易貼壁可預(yù)先在瓶壁涂一薄層血清、胎汁或鼠尾膠原等。開始培養(yǎng)時培養(yǎng)基不宜多，以保持組織塊濕潤即可，培養(yǎng)24小時后再補液，培養(yǎng)初期移動和觀察時要輕拿輕放，開始幾天盡量不去搬動，以利貼壁和生長，培養(yǎng)3~5天時可換液，一方面補充營養(yǎng)，一方面去除代謝產(chǎn)物和漂浮小塊所產(chǎn)生的毒性作用。 
原代細胞培養(yǎng)－2

2.消化培養(yǎng)法
該方法是采用前述的消化分散法，將妨礙細胞生長的細胞間質(zhì)（包括基質(zhì)、纖維等）去除，使細胞分散形成細胞懸液，然后分瓶培養(yǎng)。
某些特殊類型細胞，如內(nèi)皮細胞、骨細胞等的消化手段和步驟，將在有關(guān)章節(jié)中敘述。

3.懸浮細胞培養(yǎng)法
對于懸浮生長的細胞，如白血病細胞、淋巴細胞、骨髓細胞、胸水和腹水中的癌細胞和免疫細胞無需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋巴細胞分層液分離后接種培養(yǎng)。

4.器官培養(yǎng)
器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或組織塊后，不進行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng)，其特性仍保持原有器官細胞的組織結(jié)構(gòu)和聯(lián)系、并能存活，器官培養(yǎng)的目的和技術(shù)均與單層細胞培養(yǎng)不同，但可利用器官培養(yǎng)對器官組織的生長變化進行體外觀察。并觀察不同培養(yǎng)條件研究對器官組織的影響。器官培養(yǎng)可保持器官組織的相對完整性，可用于重點觀察細胞間的聯(lián)系、排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用。體外器官培養(yǎng)為臨床上的器官移植創(chuàng)造了便利的條件。器官培養(yǎng)的條件與細胞培養(yǎng)不同，要有特殊的要求。

1. 器官培養(yǎng)的特殊的要求
(1)需要特殊的培養(yǎng)條件 因器官離體培養(yǎng)，其營養(yǎng)和氧氣僅靠自然滲透來供給，因此，培養(yǎng)時為了確保中心不發(fā)生缺乏氧和營養(yǎng)而造成壞死，其厚度或直徑不宜超過1mm。
(2)器官內(nèi)部細胞需要有足夠的氧氣滲入 常采用以下兩種方法：
① 將器官組織塊置于培養(yǎng)基氣液面以利于氣體交換。
提高培養(yǎng)基中的氧分壓，一般需加注純氧，提高氧分壓時仍需保持5% CO2，以維持pH。
2. 器官培養(yǎng)的方法
(1)將不銹鋼網(wǎng)做成的支架，放置于培養(yǎng)皿中，高度為1/2皿高，使其表面鋪上0.5mm孔徑的濾膜。
(2)將培養(yǎng)基加入平皿中，使培養(yǎng)液剛剛接觸到濾膜，但不要使濾膜浮起。
(3)將要培養(yǎng)的器官組織平放在濾膜上，一般厚度不要超過200μm，水平面積不超過10mm2，如為肝、腎不能大于1mm2。
(4)將培養(yǎng)物置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，并加注氧氣，調(diào)整氧分壓達90%，培養(yǎng)時注意使液面與膜保持在一致的水平上。
(5)上述器官培養(yǎng)1~3周（每隔2~3天換液一次）后可用于實驗和檢測。

原代細胞的培養(yǎng)與維持

(一)原代細胞培養(yǎng)

1、靜置貼壁細胞(包括半貼壁細胞的培養(yǎng))
凡經(jīng)消化液處理實體組織來源的細胞要通過充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性，細胞接種時濃度要稍大一些，至少為5×108細胞/L，培養(yǎng)基可用Eagle(MEM)或DNEM培養(yǎng)，小牛血清濃度為10%～80%，有條件的應(yīng)在37℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在起始的2天中盡量減少振蕩，以防止剛貼壁的細胞發(fā)生脫落，漂浮。若原代貼壁細胞不是用于長期培養(yǎng)，只是用于分離繁殖或測定病毒之用，其細胞濃度可以加大，盡量貼成厚層以利病毒的效價提高和測定結(jié)果（如空斑）更加明顯、準(zhǔn)確，待細胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，此時的pH若有明顯變化，應(yīng)將原代細胞換液，即倒去舊液，換入新鮮的培養(yǎng)基，以便除去衰老、死亡的細胞和陳舊的培養(yǎng)基，使貼壁細胞能獲得充足的營養(yǎng)。
若用骨髓或外周血中的懸浮細胞經(jīng)靜置培養(yǎng)1周時，可有少量的肌樣纖維間質(zhì)細胞或基質(zhì)細胞開始貼壁生長，為了利于該貼壁細胞充分貼壁和生長，此時換液應(yīng)將細胞懸液經(jīng)低速離心后，按半量換液方式棄去舊液加入新液，然后再將細胞懸液放入原瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)反復(fù)幾次換液后，貼壁肌樣細胞逐漸形成網(wǎng)狀，此時換液可將原懸浮細胞和培養(yǎng)基移入另一新瓶，然后分別補加新鮮培養(yǎng)基(也按半量換液方式分別對半加入新液)繼續(xù)培養(yǎng)，原瓶的貼壁細胞逐漸長成單層，而新瓶中又會出現(xiàn)二次貼壁細胞，經(jīng)幾次換液也會逐漸長成單層，在此類細胞培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中往往需加入少量的維生素D3、bFGF、地塞米松、小牛血清（濃度要在20%以上），以利細胞貼壁生長。

2、懸浮細胞的培養(yǎng)
凡來自外周血、胸腹水、脾臟、淋巴結(jié)、骨髓的淋巴細胞、造血干細胞以及白血病細胞，在原代培養(yǎng)時要盡量去除紅細胞。若作用于試驗的短期培養(yǎng)，可在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，細胞濃度可在5～8×109/L范圍內(nèi)，然后進行分瓶試驗。若要將淋巴細胞及白血病細胞進行長期培養(yǎng)，淋巴細胞中要加入生長因子，白血病細胞中要加入少量的原患者血清，以利細胞生長，待細胞開始增殖甚至結(jié)成小團塊，培養(yǎng)基中pH變酸，說明細胞生長繁殖良好，一般每隔3天需半量換液一次（換液時盡量使細胞不丟失），待細胞增殖加快，濃度明顯增加，pH發(fā)生明顯變化時，此時可考慮傳代。但千萬不能急于傳代，一定要待細胞密度較高時才能進行，以防傳代失敗。

(二)原代細胞的維持

1、貼壁細胞（包括半貼壁細胞的換液）
貼壁細胞長成網(wǎng)狀或基本單層時，由于營養(yǎng)缺乏，代謝產(chǎn)物增多，pH變酸，不適宜細胞生長，此時細胞還未長成單層，未達到飽和密度，仍需繼續(xù)培養(yǎng)，因此，需采取換液方式來更新營養(yǎng)成分以滿足細胞繼續(xù)生長繁殖的需要。其換液方法比較簡單，即棄去舊液，加入與原培養(yǎng)液相同的等量完全培養(yǎng)基。若希望細胞能在較長時間內(nèi)能維持存活，但不需增殖，此時要換成含2%小牛血清的維持液。

2、懸浮細胞
凡經(jīng)培養(yǎng)后只在細胞培養(yǎng)基中懸浮生長而不貼壁的細胞，需在倒置顯微鏡下方可觀察到細胞的形態(tài)和生長現(xiàn)象，淋巴細胞的短期培養(yǎng)無需換液，但加入生長因子或有絲分裂源（PHA、PMA、COnA、PWM、LPS等）后，細胞不僅會發(fā)生轉(zhuǎn)化而且會發(fā)生分裂繁殖，此時培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分并不能維持細胞的營養(yǎng)需求，加之代謝產(chǎn)物增多，pH變酸，細胞不適宜生長，需進行換液。白血病細胞或淋巴瘤細胞體外長期培養(yǎng)時，都需換液培養(yǎng)，待達到飽和密度時才能傳代。換液時，只能采用半量換液的方式，千萬不能采取倒去舊液加入新液的方式進行換液。半量換液的方法如下：
將原培養(yǎng)瓶豎起，在30分鐘內(nèi)，若細胞沉于瓶底，可用吸管輕輕吸去一半上清棄去，再加入等量的新鮮完全培養(yǎng)基。若細胞不能沉于瓶底，可吸出細胞懸液，采用低速離心（1000r/min 10min）棄去一半上清加入等量的新鮮完全培養(yǎng)基，混勻后再轉(zhuǎn)入原瓶繼續(xù)培養(yǎng)。