Solexa高通量測(cè)序方法簡介

高通量測(cè)序發(fā)展的背景

基因決定了一個(gè)人的相貌、身高甚至疾病，它存在于每個(gè)人體細(xì)胞的ＤＮＡ中。而組成ＤＮＡ的基本物質(zhì)則是由Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ表示的４種堿基，一個(gè)人的基因組測(cè)序就是排列出其ＤＮＡ上所有堿基的順序。如果每個(gè)人都能擁有一份屬于自己的基因組圖譜，那么科學(xué)家們長期以來期待的“個(gè)性化醫(yī)療時(shí)代”就會(huì)可能成為現(xiàn)實(shí)，藥品會(huì)根據(jù)個(gè)人不同的 DNA 量身定制。

但目前的測(cè)序費(fèi)用還是極其昂貴的，非普通人所能企及�？茖W(xué)家正在研究新一代測(cè)序儀器和方法，希望有朝一日能把破譯個(gè)人“基因密碼”的費(fèi)用降低到 1000 美元。如果能夠?qū)崿F(xiàn)，普通民眾就有望在必要情況下可以把基因組測(cè)序變成一項(xiàng)常規(guī)檢查項(xiàng)目。

測(cè)序成本不斷下降

幾年前，由六個(gè)國家 16 個(gè)中心以及全球眾多科學(xué)家共同完成的 “ 人類基因組計(jì)劃 ” （ HGP ），首度解讀了人體 DNA 中所隱藏的、完整描述造就和維持人體生命的說明書。該計(jì)劃從 90 年啟動(dòng)通過 10 余年的工作，共花費(fèi)了近 30 億美元。而這其中 1995 年文特爾曾發(fā)明了著名的 “ 基因組鳥槍測(cè)序法 ” 。這種方法將基因組 DNA 切斷成小片斷，分別測(cè)序，再將他們拼接起來，大大加快了基因組測(cè)序的速度。即便如此，科學(xué)家也用了 10 余年的時(shí)間才完成了人類基因組的第一次測(cè)序工作。由于越來越多的領(lǐng)域需要用到基因組測(cè)序，開發(fā)更快更便宜的測(cè)序方法成為急迫的課題。

以末端終止法為核心第一代測(cè)序技術(shù)－化學(xué)測(cè)序方法，成型于上世紀(jì) 80 年代。測(cè)序時(shí)， DNA 分子被切斷為大的片段，測(cè)得大片段的序列后，繼續(xù)將大片段剪切為小片段，逐步測(cè)定整個(gè)基因組順序，這種方法費(fèi)事費(fèi)時(shí)，需要大量的技術(shù)人員參與，耗費(fèi)大量財(cái)力。

開始于上個(gè)世紀(jì) 90 年代的第二代測(cè)序技術(shù)，是以集成化、自動(dòng)化為基礎(chǔ)的基因測(cè)序技術(shù)，為大規(guī)模的基因測(cè)序奠定了基礎(chǔ)，測(cè)序方法也從平板膠電泳發(fā)展為毛細(xì)管電泳。從而將包括人類基因組計(jì)劃在內(nèi)的多個(gè)生物的全基因組的測(cè)序完成，其通量較第一代有明顯的大幅度的提升（代表機(jī)型： 310 、 377 、 3700 、 3100 、 3730 MegaBACE1000 、 4000 、 4500 ）。但是 ，昂貴的科研費(fèi)用還是意味著，大規(guī)�；�因測(cè)序工作大多只能局限于專業(yè)測(cè)序中心來完成，供大型、昂貴的研究項(xiàng)目之用。

近年，出現(xiàn)了一些新的技術(shù)和方法。這些技術(shù)和方法不斷得到創(chuàng)新 和改良，在保證基因組測(cè)序足夠精確度的前提下， 操作程序的優(yōu)化，測(cè)定一種基因組變得越來越簡單起來， 測(cè)試的成本也呈現(xiàn)直線下降的趨勢(shì) 。現(xiàn)在一種被稱為 “ 革命性的基因組測(cè)序技術(shù) ” 的全新測(cè)序方法，使科學(xué)家們希望只要花費(fèi)一千美元即可測(cè)得一個(gè)人的全基因組即將成為可能。

Solexa 高通量測(cè)序法原理

Solexa 方法是利用單分子陣列測(cè)試 genotyping ，此種測(cè)序法首先是將 DNA 從細(xì)胞中提取，然后將其打斷到約 100 － 200bp 大小，再將接頭連接到片段上，經(jīng) PCR 擴(kuò)增后制成 Library 。隨后在含有接頭的芯片（ flow cell ）上將已加入接頭的 DNA 片段綁定在 flow cell 上，經(jīng)反應(yīng)，將不同片段擴(kuò)增。在下一步反應(yīng)中，四種熒光標(biāo)記的染料應(yīng)用邊合成邊測(cè)序（ Sequencing By Synthesis ）的原理，在每個(gè)循環(huán)過程里，熒光標(biāo)記的核苷和聚合酶被加入到單分子陣列中�；パa(bǔ)的核苷和核苷酸片斷的第一個(gè)堿基配對(duì)，通過酶加入到引物上。多余的核苷被移走。這樣每個(gè)單鏈 DNA 分子通過互補(bǔ)堿基的配對(duì)被延伸，利用生物發(fā)光蛋白，比如螢火蟲的熒光素酶，可通過堿基加到引物后端時(shí)所釋放出的焦磷酸鹽來提供檢測(cè)信號(hào)。針對(duì)每種堿基的特定波長的激光激發(fā)結(jié)合上的核苷的標(biāo)記，這個(gè)標(biāo)記會(huì)釋放出熒光。熒光信號(hào)被 CCD 采集， CCD 快速掃描整個(gè)陣列檢測(cè)特定的結(jié)合到每個(gè)片斷上的堿基。通過上述的結(jié)合，檢測(cè)可以重復(fù)幾十個(gè)循環(huán)，這樣就有可能決定核苷酸片斷中的幾十個(gè)堿基。

Solexa 的這種方法，可在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)加入 4 種核苷的標(biāo)簽，采用邊合成邊測(cè)序（ SBS － sequencing by synthesis ），可減少因二級(jí)結(jié)構(gòu)造成的一段區(qū)域的缺失。并具有所需樣品量少，高通量，高精確性，擁有簡單易操作的自動(dòng)化平臺(tái)和功能強(qiáng)大等特點(diǎn)，此反應(yīng)可以同時(shí)檢測(cè)上億個(gè)核苷酸片斷 , 因此在同一個(gè)芯片或幾個(gè)芯片上花費(fèi)很少（只需常規(guī)方法的 1 ％）的成本就可測(cè)試全基因組。

 隨著 DNA 測(cè)序表達(dá)譜產(chǎn)品（ DNA sequencing ,expression profiling ）以及 microRNA 分析平臺(tái) -Solexa Genome Analysis System. 相繼問世，使得此種方法在更多的領(lǐng)域得到應(yīng)用。

Illumina公司的Solexa測(cè)序技術(shù)為廣大用戶提供了強(qiáng)大的下一代測(cè)序方法，為目前遺傳分析和功能基因組等熱門研究領(lǐng)域的部分熱門課題提出了全新的應(yīng)用方案。

測(cè)序與重測(cè)序

無論您需要測(cè)定的是整個(gè)基因組的序列還是基因組上一個(gè)大片斷候選區(qū)域的序列， Illumina Genome Analyzer系統(tǒng)都是當(dāng)今世界上最先進(jìn)、最經(jīng)濟(jì)的平臺(tái)。Solexa測(cè)序技術(shù)和可逆中止化合物染料（reversible terminator chemistry）奠定了在下一代測(cè)序技術(shù)中高質(zhì)量、高通量、低成本數(shù)據(jù)產(chǎn)出的基礎(chǔ)。

表達(dá)譜分析

通過對(duì)樣本中數(shù)以百萬計(jì)的cDNA標(biāo)簽同時(shí)進(jìn)行序列測(cè)定，Genome Analyzer系統(tǒng)可以使您對(duì)整個(gè)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行數(shù)字化的分析，而成本僅僅維持在與目前其他模擬化分析技術(shù)同樣的水平。由于我們的技術(shù)無需利用任何轉(zhuǎn)錄子特異性雜交探針，您可以同時(shí)進(jìn)行全基因組轉(zhuǎn)錄子的發(fā)掘與定量分析，而無需事先知道基因組的注釋情況。

小RNA鑒定與定量分析

Solexa測(cè)序技術(shù)可以提供一套全新獨(dú)特的，適用于各個(gè)物種的小RNA深度鑒定與定量分析研究平臺(tái)。通過大量的平行測(cè)序，研究人員可以發(fā)掘、鑒定并定量出任何物種全基因組水平的小RNA圖譜。應(yīng)用這種低成本快速測(cè)定數(shù)百萬標(biāo)簽序列的新方法，Illumina Genome Analyzer提供了解密小RNA圖譜獨(dú)一無二的方法。