磁珠法分離小鼠T細胞和B細胞

 

基本方案

用AUTOMACS系統(tǒng)進行總T細胞、CD4⁺細胞或CD8⁺T細胞的自動分離

 

實驗材料

1、小鼠

2、HBSS洗滌緩沖液

3、MACS緩沖液

4、磁珠

5、RPMI-10完全培養(yǎng)基

6、AUTOMACS系統(tǒng)和分選柱

7、30μm尼龍網(wǎng)或40μm預分離濾膜

 

1、用5只小鼠的淋巴結(jié)或2只小鼠的脾臟制備單細胞懸液并去除紅細胞。

 

2、細胞在10mlHBSS洗滌緩沖液中混懸后用血細胞計數(shù)器計數(shù)。

 

3、細胞懸液在4℃，200g離心10min。棄上清后將沉淀按每10⁸個細胞0.9ml MACS緩沖液的比例混懸。每10⁸個細胞加入0.1ml適當?shù)拇胖楹笤?℃孵育15min。

 

4、在孵育的時間里，打開AUTOMACS系統(tǒng)電源。按產(chǎn)品說明書中操作規(guī)程運行清潔程序。

 

5、細胞懸液在4℃，200g離心10min。棄上清，在沉淀中加入足量的MACS緩沖液使細胞濃度達到10⁸個細胞/ml，充分混懸。將細胞通過30μm尼龍網(wǎng)或40μm預分離濾膜。用0.1～0.4mlMACS緩沖液沖洗濾網(wǎng)。

 

6、細胞放到AUTOMACS的上樣通道。選擇possel程序，這樣標記的細胞將從陽性通道洗脫。

 

7、細胞懸液在4℃，200g離心10min。棄上清后將沉淀用2～5ml RPMI-10完全培養(yǎng)基混懸。計數(shù)。

 

附錄：

RPMI完全培養(yǎng)基：

       RPMI1640培養(yǎng)基含有:

       2%、5%、10%、15%或20%FBS,56℃熱滅活1h

       2μmmol/L L-谷氨酰胺

       50μmol/ml 2-ME

       100U/ml 青霉素

       100μg/ml 硫酸鏈霉素

 

RPMI-10完全培養(yǎng)基：

       配制RPMI完全培養(yǎng)基加入:

       10%（V/V）FBS

       1mmol/L 丙酮酸鈉

       50μg/ml慶大霉素

       10mmol/L HEPES

       4℃可保存2周

       過濾除菌

 

HBSS洗滌緩沖液：

       HBSS，含有：

       5%（V/V）FBS

       20mmol/L HEPES，pH7.0

       100U/ml 青霉素

       100μg/ml 鏈霉素

       4℃可保存1個月

 

MACS緩沖液：

       PBS，pH7.2

       0.5%（m/V）BSA

       2mmol/L EDTA

       過濾除菌

       用于自動MACS系統(tǒng)，室溫儲存1個月

       用于LS或LD柱時，脫氣，4℃保存