用高速固定角轉頭不連續(xù)蔗糖梯度分離細胞器

在例（十）中已介紹了用日立CR22G/21G離心機R18A轉頭，日立50ml錐底組織培養(yǎng)管分離質膜的方法。下面介紹用一般的圓底離心管（瓶），不連續(xù)（階梯）蔗糖梯度，在高速離心機上分離質膜、內質網(wǎng)、溶酶體、線粒體、過氧化酶體的方法。
設備：●主機Hitachi，CR21GⅡ（或21G）高速冷凍離心機
         ●轉頭：R20A2固定角式轉頭8×50ml，Nmax＝20,000rpm，RCFmax＝48,000xg，頃角34。，Rmax ＝10.74cm，Rmin＝5.56cm
         ●離心管：50PA高速管，有PP壓蓋，標稱容量50ml實際容量38ml或50PP離心瓶，有螺旋蓋，實際容量34ml，或Nalgene 50PPCO離心瓶，實際容量40ml
離心參數(shù)：18,000rpm（39,120xg），4℃，5小時，加速“5”，減速“4”
分離步驟：
1. 樣品以鼠肝為例，成年鼠肝勻漿，R20A2轉頭，4000rpm（約1900xg），4℃離心15分鐘，加速“9”，減速“9”
2. 倒去上清，沉淀用1mM NaHCO3稀釋，再次離心4000rpm，15分，4℃，加速“9”，減速“9”
3. 沉淀按濕重1g/ml，用1mM NaHCO3稀釋
4. 將（3）與40％w/w蔗糖液混合成樣品液
5. 根據(jù)離心管（瓶）的實際容量分成5等分，按每等分容量分別自上而下在離心管（瓶）中配置10％，28％，30％，40％w/w蔗糖液，底部是等容量的樣品液
6. 離心：18,000rpm（39,120xg），4℃，加速：“5”，減速“4”，5小時
7. 結果：●質膜分布在蔗糖梯度10％--28％界面之間
             ●內質網(wǎng)分布在蔗糖梯度28％--33％界面之間
             ●溶酶體分布在蔗糖梯度33％--38％界面之間
             ●線粒體及過氧化酶體分布在離心瓶（管）近底部蔗糖梯度45％附近

討論：
1. 經(jīng)過長時間離心，由于濃度擴散，初始階梯梯度已變成了非線性分段連續(xù)梯度，已不存在蔗糖在某一點的濃度突變
2. 梯度取出：可用手工分層取出（每個離心管收集成50—100管，分別測試OD，并繪出OD（縱坐標）→管數(shù)（橫坐標）曲線可以看出每種亞細胞構造的OD峰
或用日立DGF—U密度梯度自動制備和收集儀連續(xù)收集，DGF—U出液管直接連接到分光光度計流動池連續(xù)測OD后并在記錄儀上繪出OD—容量曲線后用自動分部收集器收集成100管。根據(jù)OD峰位置判定各種亞細胞構造所在的收集管。
3. 收集的較純亞細胞構造還可以進一步用線性連續(xù)蔗糖梯度分離和純化。
4. 以上方法分離產(chǎn)物主要是大片（如質膜），大顆粒（如重線粒體）的亞細胞構造，如果要分離更分豐富的亞細胞構造，可將本文分離步驟改為（1）肝勻漿，1000xg×10分鐘，留上清，沉淀稀釋后在1000xg×10分鐘，再留上清，（2）二次上清合并后，用上述轉頭18,000rpm×2.5小時，4℃，加速“9”，減速“9”，取沉淀繼續(xù)運用上述分離步驟
（從3到7）

作者：余興明   電話：13764301893,yuxingming@techcomp.cn