牛體內(nèi)重組牛生長(zhǎng)激素 (rbST) 快速高靈敏度檢測(cè)

牛體內(nèi)重組牛生長(zhǎng)激素 (rbST) 快速高靈敏度檢測(cè)

Gaud Pinel1 ， Sandrine Roulet-Rochereau1 ， Marie-Hélène Le Breton1,2 ，
Sylvain Chéreau1 ， Fabrice Monteau1 ， Paul Silcock3 ，與 Bruno Le Bizec1
1 Laboratoire d’ Etude des Résidus et Contaminants dans les Aliments (LABERCA) ， ONIRIS ， Nantes ， France 法國(guó) LABERCA 化學(xué)實(shí)驗(yàn)室
2 瑞士洛桑雀巢公司，雀巢研究中心
3 英國(guó)曼徹斯特沃特世公司

應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

牛注射了重組牛生長(zhǎng)激素，過(guò)幾天后檢測(cè)藥物在牛體內(nèi)的殘留。首次得到了明確的檢測(cè)結(jié)果，可用于此類藥物的使用監(jiān)控。

■ Xevo TQ MS 的高靈敏度可準(zhǔn)確檢測(cè)生物基質(zhì)中的重組牛生長(zhǎng)激素（ rbST ），符合 2002/657/EC 要求。
■ 方法的靈敏度高，非常適合用于在給藥幾天后檢測(cè)動(dòng)物血液中痕量的殘留激素藥物。
■ Xevo TQ MS 提供重復(fù)性好的結(jié)果，且基質(zhì)效應(yīng)很低，這對(duì)于藥物監(jiān)控計(jì)劃實(shí)施中的常規(guī)分析來(lái)說(shuō)是十分重要的。

沃特世解決方案

■ ACQUITY UPLC ， Xevo TQ MS

關(guān)鍵詞

■ rbST ， reST ，生長(zhǎng)激素，食品安全

簡(jiǎn)介

動(dòng)物性食品安全控制是政府、國(guó)際法規(guī)機(jī)構(gòu)與組織的重要任務(wù)，應(yīng)該在食品進(jìn)入消費(fèi)環(huán)節(jié)之前就對(duì)食品安全進(jìn)行有效的檢測(cè)和控制。因?yàn)樯鲜泻蟮氖称钒踩�事件可能影響消費(fèi)者信心與國(guó)際貿(mào)易。

重組牛生長(zhǎng)激素（ rbST ），又稱為生長(zhǎng)激素，在一些國(guó)家通常作為豬或牛的生長(zhǎng)促進(jìn)劑，將其用于乳�？梢栽黾优Ｄ坍a(chǎn)量 1,2 。然而，生長(zhǎng)激素的使用有嚴(yán)格的法律規(guī)范，在歐盟國(guó)家是完全禁用的 3,4 。但是，這項(xiàng)法規(guī)的執(zhí)行面臨著很大的困難，主要是因?yàn)槿狈τ行У姆治龉ぞ邅?lái)檢測(cè)是否存在濫用該激素的情況。此分析的困難在于生長(zhǎng)激素本身是蛋白質(zhì)，且在生物基質(zhì)中濃度較低，而樣品基質(zhì)組成又十分復(fù)雜。至今為止，分析方法僅僅局限為酶聯(lián)免疫檢測(cè)，這個(gè)方法不能將天然存在的激素與重組激素分離開(kāi)來(lái)；盡管也有其它應(yīng)用報(bào)導(dǎo)，但都不能專屬性很強(qiáng)地檢測(cè)生理水平的重組牛生長(zhǎng)激素（ rbST ） 5,6 。

直到最近才開(kāi)發(fā)出了一項(xiàng)直接檢測(cè)生物基質(zhì)中重組牛生長(zhǎng)激素（ rbST ）的方法 7,8 ，這個(gè)方法是將重組生長(zhǎng)激素用胰蛋白酶進(jìn)行水解，然后分析生長(zhǎng)激素專有的 N- 端肽鏈。事實(shí)上，天然激素的 N- 端氨基酸是丙氨酸，而重組激素的 N- 端氨基酸是甲硫氨酸。

此應(yīng)用文章展示了使用 Waters® XevoTM TQ MS 分析注射了重組激素的動(dòng)物血漿樣品中的藥物。在注射后幾天進(jìn)行檢測(cè)，可清晰檢測(cè)出結(jié)果，展示了一流水平。

實(shí)驗(yàn)部分

重組激素標(biāo)準(zhǔn)品

重組牛生長(zhǎng)激素（ rbST ）標(biāo)準(zhǔn)品與重組馬生長(zhǎng)激素（ reST ）分別購(gòu)自哈勃 UCLA 醫(yī)學(xué)中心國(guó)家激素與垂體項(xiàng)目（美國(guó)托蘭斯）以及 Bresagen 有限公司（澳大利亞 T hebarton ）。

樣本制備

重組牛生長(zhǎng)激素在血漿中的樣本提取、純化步驟依照文獻(xiàn)進(jìn)行。 7,8

MS 條件

MS 系統(tǒng)： XEVO TQ MS
離子化模式： ESI+
毛細(xì)管電壓： 3 kV
源溫度： 150 ℃
脫溶劑溫度： 550 ℃
脫溶劑氣速： 800 L / 小時(shí)
碰撞氣流速： 0.15 mL/ 分

MRM 方法參數(shù)

MRM 通道通過(guò) Masslynx 軟件中的 IntelliStartTM 行獨(dú)立的參數(shù)優(yōu)化，詳見(jiàn)表 2 。

結(jié)果與討論

LC/MS/MS 條件優(yōu)化

ACQUITY UPLC 系統(tǒng)對(duì)胰蛋白酶水解的 N- 端肽片段又很好的保留和分離效果，總運(yùn)行時(shí)間 8 分鐘，重組牛生長(zhǎng)激素（ rbST ）與重組馬生長(zhǎng)激素（ reST ）的 N- 端保留時(shí)間分別為 2.74 和 2.79 分鐘（圖 1 ）。

重組牛生長(zhǎng)激素（ rbST ） N- 端肽鏈在電噴霧正離子模式產(chǎn)生雙電荷的離子 [M+2H]2+=913 ，將此離子作為母離子。根據(jù) 2002/657/EC 歐盟委員會(huì)決議 10 ， MRM 方法中選擇了兩個(gè)子離子用于確證；重組馬生長(zhǎng)激素（ reST ）作內(nèi)標(biāo)物，在樣品中的濃度為 100 ng/mL ，其 N- 端肽鏈在電噴霧正離子模式產(chǎn)生三價(jià)電荷的離子 [M+3H]3+= 623 ，將其作為母離子。

動(dòng)物注射生長(zhǎng)激素后體內(nèi) rbST 的檢測(cè)

此方法用于檢測(cè)注射生長(zhǎng)激素后的動(dòng)物樣品。對(duì)奶牛一次性皮下注射 500mg Lactatropin® 藥物，然后取樣分析。

圖 1 對(duì) 10 ng/mL 的 rbST 和 reST 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣， UPLC(ESI+)/MS/MS 的 MRM 特征離子信號(hào)分別為 rbST 的 N- 端碎片離子為 913>774 和 913>1047 ； reST 的 N- 端碎片離子為 623 >795 和 623 >530

圖 2 使用 UPLC （ ESI+ ） /MS/MS 分析注射藥物前（ D0 ）與注射后兩天（ D2 ）采集到的血漿樣本的的 MRM 特征離子信號(hào)圖譜

圖 2 顯示了注射藥物前采集到的血漿樣本得到的譜圖（ D0 ）以及注射藥物兩天后血漿樣本的譜圖（ D2 ）。

圖 2 的結(jié)果表明：可以在給動(dòng)物注射生長(zhǎng)激素兩天后在奶牛的血漿中檢測(cè)到 rbST 。對(duì)采集到的特征信號(hào)分析表明此方法可以對(duì)生長(zhǎng)激素這個(gè)蛋白進(jìn)行明確的確證，符合 2002/657/EC 的要求，同時(shí)確認(rèn)了檢測(cè)方法的靈敏度。

與預(yù)計(jì)的動(dòng)物血漿蛋白水平一致�；�質(zhì)干擾幾乎檢測(cè)不到，在實(shí)際血漿樣本中的良好線性可保證對(duì) rbST 的進(jìn)一步相對(duì)定量結(jié)果，在注射生長(zhǎng)激素兩天后還可以檢測(cè)到血漿中 50 ppb 的藥物，與以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致 7,11 。表 3 顯示了平行進(jìn)樣 10 次得到的分析結(jié)果，這充分說(shuō)明 Xevo TQ MS 在檢測(cè)低含量復(fù)雜樣品時(shí)能夠提供重復(fù)性好的數(shù)據(jù)。

結(jié)論

■ Xevo TQ MS 的高靈敏度可準(zhǔn)確檢測(cè)生物基質(zhì)中的重組牛生長(zhǎng)激素（ rbST ），符合 2002/657/EC 要求
■ 方法的靈敏度高，非常適合用于在給藥幾天后檢測(cè)動(dòng)物血液中痕量的殘留激素藥物
■ Xevo TQ MS 提供重復(fù)性好的結(jié)果，且基質(zhì)效應(yīng)很低，這對(duì)于藥物監(jiān)控計(jì)劃實(shí)施中的常規(guī)分析來(lái)說(shuō)是十分重要的

參考文獻(xiàn)

[1] Burton JL, McBride BW, Block E, Glimm DR and Kennelly JJ. A review of bovine growth hormone. Canadian Journal of Animal Science. 1994; 74: 167-201.

[2] Bauman DE and Vernon RG. Effects of exogenous bovine somatotropin on lactation. Annual review of Nutrition. 1993, 13: 437-461.

[3] Council Decision of 20 December 1994 amending Decision 90/218/ EEC concerning t he placing on t he market and administration of bovine somatotropin (BST). Official Journal of the European Communities. 1994/936/EC

[4] Council Decision of 17 December 1999 concerning the placing on the market and administration of bovine somatotropin (BST) and repealing Decision 90/218/EEC. Official Journal of the European Communities. 1999, 1999/879/EC.

[5] Blokland MH, Sterk SS, Van Ginkel LA, Stephany RW, and Heck AJR. Analysis for endogenous and recombinant porcine somatotropine in serum. Analytica Chimica Acta 2003, 438, 201-206.

[6] Pinel G, Buon R, Aviat F, Larre C, André-Fontaine G, André F, and Le Bizec B. Recombinant bovine somatotropin misuse in cattle. Evaluation of western blotting and 2D electrophoresis methods on biological samples for the demonstration of its administration. Analytica Chimica Acta 2005, 529, 41-46.

[7] Le Breton M H, Rochereau-Roulet S, Pinel G, Bailly-Chouriberry L, Ryc hen G, Jurjanz S, Goldmann T, and Le Bizec B. Direct determination of recombinant bovine somatotropin in plasma

from a treated goat. Rapid Communication in Mass Spectrometry. 2008; 22: 3130-3136.

[8] Le Breton M H, Rochereau-Roulet S, Pinel G, Cesbron N and Le Bizec B. Elimination kinetic of recombinant somatotropin in bovine. Analytica Chimica Acta. 2009; 637: 121-127.

[9] Monteau F, Antignac JP, Pinel G, Silcock P, Hancock P, Le Bizec B. Xevo TQ MS:Adressing new challenges in the field of growth promoters in biological samples. Waters Application Note 2009.

[10] Commission Decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results. Official Journal of the European Communities. 2002, 2002/657/EC.

[11] Le Breton M H, Rochereau-Roulet S, Chereau S, Pinel G, Delatour T and Le Bizec. Identification of cows treated with recombinant bovine somatotropine. Journal of Agricultural and Food Chemistry, DOI:10.1021/jf903032q.