原代細胞培養(yǎng)后，碘克沙醇梯度溶液分析主要細胞器

試劑和器材： 
1. OptiPrepTM（600g/L的碘克沙醇）；
2. 勻漿介質：0.25mmol/L蔗糖溶液、1mmol/L乙二胺四乙酸、20mmol/L Hepes-NaOH，pH7.4；
3. OptiPrepTM稀釋液：0.25mmol/L蔗糖、6mmol/L乙二胺四乙酸、120mmol/L Hepes-NaOH，pH7.4；
4. 碘克沙醇（500g/L）工作液（IWS）：5體積OptiPrepTM +1體積OptiPrepTM稀釋液；
5. 按要求向勻漿介質和OptiPrepTM稀釋液中加入蛋白酶抑制劑；
6. 使用勻漿介質制備好的輕線粒體組分；
7. Dounce勻漿器（寬松配制，Wheaton B型）；
8. 兩室梯度制備儀或Gradient MasterTM；
9. 5ml規(guī)格注射器（內徑大約為0.8mm），帶金屬套管針；
10. 超速離心機，配有吊桶式轉子（離心管容量為17ml）；
11. 梯度收集器，用來首先收集低密度或高密度的梯度液；

實驗方法：
   原代細胞培養(yǎng)后，所有操作均在0—4℃下進行。
1. 使用勻漿介質稀釋碘克沙醇工作液，獲得碘克沙醇濃度為190g/L及270g/L的梯度溶液，將溶液置于冰上；
2. 使用寬松配制的Dounce勻漿器（用研杵研磨2—3次），在3.0ml的勻漿介質中重懸輕線粒體沉淀；
3. 使用碘克沙醇工作液將混懸液碘克沙醇濃度調整到300g/L；
4. 使用兩室梯度制備儀或者Gradient MasterTM從兩種梯度溶液中各取6ml來制備線性梯度，置于可在吊桶式轉子中離心的管中；
5. 使用注射器和金屬套管針在梯度溶液下鋪入3—4ml在第3步制備的混懸液；
6. 在梯度溶液頂層鋪1—2ml勻漿介質使得管中液面離頂部大約3mm，在適宜的吊桶式轉子中以大約70000g離心1.5—2h；
7. 可以用密度高的介質來向上取代或者在凹液面上吸出來的方法先收集梯度溶液中1ml低密度部分。或者，通過管刺破或小心地用細的金屬套管針探入管子的底部（與蠕動泵連接）來先收集密度高的組分；