Cytodex 1, Cytodex 3 球形微載體的使用
Cytodex 1, Cytodex 3 球形微載體的使用
用于細胞培養(yǎng)的微載體
微載體培養(yǎng)（microcarrier culture）是一種用于高產量培養(yǎng)貼壁細胞的實用技術。CytodexTM專用于培養(yǎng)各類動物細胞，其培養(yǎng)體積可以從數毫升到6000升以上。應用Cytodex微載體技術，可以實現簡單的貼壁細胞懸浮化培養(yǎng)，每毫升培養(yǎng)液可得到數百萬細胞。微載體適于搖瓶、轉瓶、攪拌罐以及WAVE生物反應器等各種培養(yǎng)系統。
應用范圍
Cytodex技術為進行動物細胞的培養(yǎng)提供了新的選擇。該微載體為動物細胞的生長提供了適宜的表面，并可用于懸浮培養(yǎng)系統。還可用于增加單層細胞培養(yǎng)容器 （例如培養(yǎng)板、 培養(yǎng)皿及培養(yǎng)瓶）及灌注室（perfusion chambers）中的細胞產量。其應用范圍為大量生產各類細胞、病毒及重組細胞產物（例如，干擾素，酶，核酸，激素）；研究細胞貼壁、分化及細胞功能；灌注柱式培養(yǎng)系統（perfusion column culture systems）；顯微鏡檢查研究；獲取有絲分裂細胞；分離細胞；膜研究；細胞的保存和運輸，細胞遷移的檢測及標記化合物的攝取研究。
產品特性
Cytodex 的設計能夠滿足微載體技術的特殊需要。
●Cytodex 的大小和密度經優(yōu)化處理，以保證培養(yǎng)各類細胞時使其生長良好，產量提高。
●培養(yǎng)基架為生物學惰性，可為懸浮微載體培養(yǎng)提供堅實而非剛性的培養(yǎng)面。
●微載體透明，可直接使用顯微鏡觀察或染色后觀察。
Cytodex 1以交聯葡聚糖基架 （cross-linked dextran matrix）為基礎，該基架被帶正電荷的N，N二乙胺基乙基基團（N, N-diethylaminoethyl groups）取代。該帶電基團遍布于整個微載體基架中。
Cytodex 3含有一層較薄的變性膠原， 與交聯葡聚糖基架化學偶聯。 Cytodex3 上的變性膠原層易被胰蛋白酶和膠原酶等多種蛋白酶消化，因此，能在維持細胞最大活性、功能和完整性的同時將細胞從微載體上分離出來。
Cytodex的參數
如何選擇Cytodex
關于如何選擇適合于某種特定應用的Cytodex的具體細節(jié)請參閱 《微載體細胞培養(yǎng)： 原理與方法》（18-1140-62）手冊，GE Healthcare可提供本書。Cytodex1適用于通用微載體培養(yǎng)（general purpose microcarrier culture），尤其適用于大多數已建立的細胞系（established cell lines）。在對培養(yǎng)產物的最大回收率無要求時，該微載體也可用于原代細胞和正常二倍體細胞系的培養(yǎng)。Cytodex3是用于某些難以生長的細胞、分化細胞培養(yǎng)系統、尤其是具有上皮樣形態(tài)學特征細胞的首選微載體。此外，在逐級擴增培養(yǎng)（scaling up）和需要最大限度的保留細胞活性和膜完整性的簡單回收細胞時，推薦使用該微載體。
注意：Cytodex 3可以提供通用膠原包被的細胞貼壁表面。
用法說明
應用Cytodex進行微載體培養(yǎng)的具體細節(jié)，請參閱 《微載體細胞培養(yǎng)： 原理與方法》（18-1140-62）手冊，GE Healthcare 可提供本書。
準備工作
干燥的微載體在無 Ca 2＋和 Mg 2＋的磷酸緩沖液（PBS）（每克Cytodex加 50-100ml）中在室溫下浸
泡膨脹 至少 3 小時。棄去上清液，用新配制的無 Ca 2＋、Mg 2＋的 PBS（每克 Cytodex 加30-50ml）洗滌微載體數分鐘。棄去 PBS，換上新的無 Ca 2＋、Mg 2＋的 PBS（每克Cytodex 加30-50ml），然后，微載體溶液用高壓滅菌法滅菌（115℃，15min，15psi）。Cytodex非常穩(wěn)定，可以反復（至少5 次）長時間（130℃，12h，27psi）進行高壓滅菌而不影響其性能。所有溶液的 pH應為 7.4。
注意：在水化 Cytodex3 時，最初，Cytodex3 的表面張力有時會阻止微載體的濕化和沉降。如果出現這種情況，在第1次水洗所用的PBS 中加入Tween 80 （每100ml PBS加 2-3滴 Tween 80）以預防。
Cytodex 也可以用乙醇消毒。 微載體在用無Ca 2+、Mg 2＋的 PBS 膨脹后沉降，棄去上清液，換上 70％（體積比）的蒸餾水稀釋乙醇。用該溶液洗兩遍微載體，然后移入新的70％的乙醇溶液（每克Cytodex 加 70-100ml）孵育過夜。然后，移去乙醇溶液，在使用前，Cytodex用無菌的無Ca 2＋、Mg 2＋PBS（每克Cytodex加50ml）洗 3 遍，用培養(yǎng)基（每克Cytodex加 20-50ml）再洗 1遍。
在使用前， 待無菌的微載體沉降后， 棄去上清液，用預熱過的培養(yǎng)基（每克 Cytodex 加 20-50ml）簡
單地洗1遍微載體。當微載體沉降后，倒掉上清液，將微載體轉移至培養(yǎng)容器中。
細胞培養(yǎng)容器
有關培養(yǎng)容器的詳細內容，請參閱《微載體細胞培養(yǎng)：原理與方法》手冊。 簡而言之，微載體培養(yǎng)液可置于各類細胞培養(yǎng)容器中。但是，應用一些在輕微攪動即可使微載體均勻懸浮的容器所獲得的效果最佳，如WAVE生物反應器。那些在應用了能有效的混合懸液但不產生高剪切力的裝置能夠形成一個均勻的培養(yǎng)環(huán)境的容器就是進行通用微載體培養(yǎng)的最佳容器。在選擇培養(yǎng)容器時，一定要考慮一些設計標準。如在培養(yǎng)過程中，攪拌槳不能和容器的內表面有任何接觸，否則，就會破壞微載體。同樣，軸承浸沒在培養(yǎng)基內的旋轉式
容器（spinner vessels）也不合適，這樣，微載體可能會被旋轉的軸承擠碎。市場上可購買到各種配套設計的系統，選擇哪種系統主要根據所需培養(yǎng)容器的大小而定。此外，對于實驗室，中試（pilot）及大規(guī)模生產應用還有很多其它培養(yǎng)容器。請聯系GE醫(yī)療系統集團了解更多信息。
注意：玻璃培養(yǎng)器皿在使用前一定要硅化處理。WAVE 細胞培養(yǎng)袋無需任何處理即可進行微載體細胞的培養(yǎng)。在《WAVE 細胞培養(yǎng)手冊：原理與方法》 手冊中對WAVE中微載體細胞培養(yǎng)方法有詳細介紹。
細胞培養(yǎng)程序
確切的細胞培養(yǎng)程序取決于細胞的種類和培養(yǎng)容器。在《微載體細胞培養(yǎng)：原理與方法》手冊中對細胞培養(yǎng)
程序有詳細介紹。根據系統的設計，微載體培養(yǎng)液通常含有1-5克/升的Cytodex，接種5×104-2×105細胞/毫升， 按20-60rpm速度攪拌。灌注微載體培養(yǎng)液（Perfused microcarrier cultures）可含高達20
g/升Cytodex。在首次進行懸浮微載體培養(yǎng)時，可參考以下介紹的一種方法。培養(yǎng)液的體積和接種量的大小應根據培養(yǎng)量的不同做相應的調整。配制100毫升的培養(yǎng)液， 應將0.3克的Cytodex溶于30ml培養(yǎng)基中，
加入到旋轉式容器。再接種107細胞于該培養(yǎng)液中，輕輕混勻，37℃孵育。一旦細胞牢固地貼壁在微載體的表面，即開始連續(xù)攪動。細胞貼壁所需要的時間主要取決于該類細胞的貼壁效率（attachment efficiency）。如果細胞貼壁的時間過長，需要間斷性（例如，每30分鐘攪動2分鐘）攪動培養(yǎng)液以保證細胞和微載體的均勻分布。然后，將培養(yǎng)液的容積增加到50毫升。攪拌的速度取決于培養(yǎng)容器，而且要足夠快以防止微載體沉降。1至2天后，培養(yǎng)液體積增加至100毫升，3至5天后，部分培養(yǎng)基需要更換。培養(yǎng)不同類型的細胞，該程序可能需要做一些相應的調整。
細胞生長的監(jiān)測
從培養(yǎng)物中提取有代表性的微載體樣本直接用相差顯微鏡檢查或用用蘇木紫染色后在顯微鏡下進行檢查。檢
測細胞數量最好的方法是使用標準 的 細 胞 核 記 數 法 （ standard nucleus extrusion method ）。（Sanford， K.K.， Earle , W.R., Evans, V.J. et al., J. Nat. Cancer Inst. 11(1951)773－795）。
細胞的回收
有多種方法可將細胞從Cytodex中移出。最常用的方法是使用蛋白水解酶如胰蛋白酶，膠原蛋白酶進行消化的標準方法。用胰蛋白酶回收細胞時，可使微載體沉降，倒掉培養(yǎng)基，再用pH7.6、含0.02％（質量體積比）乙二胺四乙酸（EDTA）的無Ca 2＋、Mg 2＋的PBS洗微載體5分鐘。
EDTA-PBS溶液的量應按Cytodex /克加50-100毫升。然后將EDTA-PBS溶液棄去，換上胰蛋白酶-EDTA（Cytodex/克加約30-50毫升）。然后在胰蛋白酶-EDTA溶液中將微載體混勻，37℃孵育，間歇式混合。15分鐘后，加入含血清的培養(yǎng)基（Cytodex/克加20-30毫升培養(yǎng)基）中止胰蛋白酶的作用。此時，微載體內附著的所有細胞可通過輕輕的攪動脫落下來。再通過單位重力（unit gravity）離心沉降（常規(guī)回收法）
或通過直徑100微米的過濾器過濾（回收率最高）將消化下來的細胞與微載體分離，分離的細胞用于接種到
下一輪的微載體培養(yǎng)中（比如，在逐級放大生產過程中）。如果用上述EDTA-胰蛋白酶回收方法不能得到滿意的細胞回收率，可以進一步對消化過程參數進行仔細的優(yōu)化，同時將所使用胰蛋白酶溶液的活性標準化。 請聯系GE醫(yī)療系統集團了解更多信息。
注意：當從 Cytodex中回收細胞用于接種下一輪微載體培養(yǎng)基時，回收溶液應為單一懸浮細胞，而且應細胞活率最高、膜結構完整及貼壁效率高，這一點特別重要。應用Cytodex 3時，用膠原酶也很方便，其使用方
法如下。停止攪動讓微載體沉降。從培養(yǎng)液中移出所有培養(yǎng)基， 用pH7.6， 含0.02％（質量體積比）
EDTA的無Ca 2＋、Mg 2＋的PBS洗5分鐘。Cytodex/克應加EDTA溶液50-100毫升。 然后將EDTA-PBS
溶液移去，換上膠原酶溶液（每克Cytodex加約30-50毫升）。 此后的步驟與胰蛋白酶回收法相同。為了
在收集后得到最大的回收率，也可以使用葡聚糖酶（dextranase）將細胞從Cytodex上分離。該 酶 可 以 消 化 Cytodex 的 葡 聚 糖 基 架（dextran-based matrix），用該酶的溶液消化15分鐘后，可以得到
游離細胞懸液。
質量控制
每個批次的Cytodex都要經過嚴格的檢驗測定其理化和功能特性。每種細胞都要培養(yǎng)一周以上的時間以確保微載體能支持高密度細胞生長。所有批次Cytodex產品都可以提供一份含有這些檢測結果的質量分析證書（Certifi cate of Analysis），可以來函索取。
供應與儲存
Cytodex產品為干燥粉末，在使用前必須水化和滅菌。以下是供貨包裝規(guī)格：
未開封的 Cytodex 在干燥條件下儲存，有效期達 5 年以上，用前述方法水化和滅菌的 Cytodex，可在4℃下、在PBS 中無菌儲存至少兩年。
