microRNA芯片高通量篩選發(fā)現(xiàn)miR-95通過抑制SNX1基因促進結(jié)腸癌細胞增殖

 

microRNA是⼀類約22個核苷酸長度的非編碼RNA小分子，⼀般通過與mRNA的3‘UTR區(qū)域相互作用從而抑制相關(guān)基因的表達。據(jù)研究表明，microRNAs在轉(zhuǎn)錄后水平上至少調(diào)控了三分之⼀的人類基因。目前最新的microRNA數(shù)據(jù)庫（miRBase）版本號是17.0（April 2011，www.mirbase.org），涵蓋了153個物種、共19724條成熟microRNA序列。雖然microRNA的研究進展神速，但是大多數(shù)microRNAs在生理或病理過程中發(fā)揮作用的機制仍未被揭示出來。

 

結(jié)腸癌（colorectal carcinoma，CRC）是世界第三大癌癥，雖然在過去幾十年中結(jié)腸癌的治療技術(shù)取得了長足的進步，但是結(jié)腸癌的分子病理機制仍未被了解清楚。過去的研究發(fā)現(xiàn)了⼀些蛋白編碼基因（例如：P53，APC，K-ras，DCC等）可能與結(jié)腸癌的形成有關(guān)，但是在結(jié)腸癌形成過程中發(fā)揮作用的microRNA卻⼀直沒有被發(fā)現(xiàn)。

 

在本文中，復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院黃朝暉博士在導師杜祥教授和上海市腫瘤研究所癌基因和相關(guān)基因國家重點實驗室何祥火研究員指導下利用基因芯片高通量篩選的方法，找到了影響結(jié)腸癌增殖速度的microRNA——miR-95，并鑒定了miR-95的下游靶基因SNX1。該研究成果發(fā)表在2011年3月的Cancer Research（影響因子8.234）上�；�因芯片技術(shù)服務由上海伯豪生物技術(shù)有限公司/生物芯片上海國家工程研究中心（）完成。

 

 

研究小組首先選取了10對結(jié)腸癌組織和癌旁組織，用microRNA芯片（Agilent microRNA microarray）進行分析，共發(fā)現(xiàn)49條有表達差異的microRNA。隨后從中選取了幾個microRNA用miRNA擬似物轉(zhuǎn)染分析實驗（miRNA mimics transfecJon assay）分析它們對結(jié)腸癌細胞生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-95有最強的促進結(jié)腸癌細胞增殖的能力。而以往也有報道，在多種腫瘤（結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌等）中能觀察到miR-95的過表達。這樣的結(jié)果表明，miR-95表達量的變化很有可能與細胞癌變過程有關(guān)。

 

用慢病毒轉(zhuǎn)導的方法，研究小組構(gòu)建了穩(wěn)定表達miR-95的HCT-116和LoVo細胞系（兩種結(jié)腸癌細胞），通過細胞增殖實驗（cell proliferation assay）和克隆形成實驗（colony formation assay）發(fā)現(xiàn)，miR-95表達上調(diào)可顯著促進結(jié)腸癌細胞增殖。而用RNAi的方法降低miR-95的表達量則會降低結(jié)腸癌細胞的生長速度。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-95的LoVo細胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染慢病毒空載體的LoVo細胞注射到裸鼠中觀察腫瘤細胞的生長速度，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)高表達miR-95的腫瘤細胞生長更快。這樣就從體外實驗和體內(nèi)實驗兩個方面證實miR-95能促進結(jié)腸癌細胞增殖。

 

綜上，該研究小組通過microRNA芯片篩選到了在結(jié)腸癌中差異表達的49種microRNA，通過microRNA擬似物轉(zhuǎn)染分析實驗確定miR-95為初步的研究對象。隨后通過⼀系列體內(nèi)、體外實驗證實，miR-95確實能促進結(jié)腸癌細胞的增殖。

 

 

microRNA⼀般通過抑制下游基因來發(fā)揮作用，由于前面的研究結(jié)果表明miR-95促進腫瘤細胞的增殖，那么它所抑制的下游基因應該是腫瘤抑制基因。研究小組用TargetScan預測了一些miR-95的靶基因，采用熒光素酶報告基因分析（luciferase reporter assay）發(fā)現(xiàn)，SNX1受miR-95抑制最為顯著。而在SNX1的3‘UTR區(qū)域引入突變之后，SNX1就不被抑制了。Western實驗也顯示，在結(jié)腸癌細胞中過表達miR-95，那么SNX1蛋白量降低；而抑制miR-95，SNX1蛋白含量則會升高。這些結(jié)果都表明：SNX1是miR-95的下游靶基因。

 

在結(jié)腸癌細胞中用siRNA抑制SNX1的表達能促進結(jié)腸癌細胞的增殖，這⼀現(xiàn)象和增加miR-95的表達量⼀致。而共轉(zhuǎn)染實驗顯示，在敲除了SNX1的細胞株中，再抑制miR-95的表達量，也不能使細胞增殖速度回到正常水平。而在miR-95高表達、細胞增殖速度很快的細胞系中，增加SNX1的表達量則能使細胞增殖速度下降。這些現(xiàn)象表明，在結(jié)腸癌細胞中，miR-95通過抑制SNX1來促進細胞增殖。

 

綜上所述，該研究利用microRNA芯片篩選得到了影響結(jié)腸癌增殖速度的microRNA——miR-95，并進⼀步闡明了miR-95在結(jié)腸癌中的功能和分子機制，提示microRNA在結(jié)腸癌中扮演癌基因角色。該研究對于結(jié)腸癌分子機制的進⼀步揭示和藥物開發(fā)具有重要意義。

 

Huang Z, Huang S, Wang Q, Liang L, Ni S, Wang L, Sheng W, He X, Du X. MicroRNA-95 promotes cell proliferation and targets sorting Nexin 1 in human colorectal carcinoma. Cancer Res. 2011, 71(7):2582-9.  （影響因子8.234）

使用服務種類：Agilent miRNA芯片服務