淺談熒光在酶標儀上的應用以及新一代酶標檢測系統（Paradigm+Tune）的優(yōu)勢

        我們知道目前生命科學及現代分子生物學主要集中在對核酸和蛋白質等生物大分子的分析以及進行一些細胞水平的研究。傳統的分析方法是采用放射性同位素作為一種示蹤劑，標記在各種生物大分子或者細胞中來研究它們之間的相互作用和變化，但是放射性同位素對環(huán)境具有一定的破壞性，對人體健康也具有一定的損害，所以各國的科學家都致力于研究和應用高靈敏度的非同位素檢測方法，利用熒光探針作為一種標記物，以其自身的一些優(yōu)勢而得到廣泛的應用。目前對熒光進行檢測的儀器種類很多，例如我們常見的熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀、多功能讀板儀（酶標儀）等，普通的熒光顯微鏡只能觀察物質形態(tài)，不能給出量化指標，而流式細胞儀又因其價格昂貴和操作復雜不能得到廣泛的應用。酶標儀作為一種熒光信號檢測儀器，具有很多優(yōu)勢，不但價錢便宜、個頭小、操作簡便，而且還可以根據熒光信號特點和強弱來對物質進行定性和定量的分析。目前市面上支持熒光檢測的多功能酶標儀種類很多，例如Molecular Devices的SpectraMax系列的M2，M3，M4和M5，和目前市面上唯一一款可以完成快速動力學實驗的Flexstation 3等。

 

 

熒光探針（熒光染料分子）在光的照射下，物質的電子吸收能量后，可由低能級的電子層（內電子層）跳到高能級的電子層。此時，電子由低能態(tài)進入高能態(tài)。高能態(tài)的電子是不穩(wěn)定的，他會在極短的時間（10-8s）內，以輻射光量子的形式釋放能量后，再回到原來的能態(tài)。這時發(fā)射出的波長比激發(fā)光的波長要長，如果在可見光波長的范圍內，為人眼所能看見的光，這種光稱之為熒光。熒光是發(fā)光體分子中處于激發(fā)態(tài)的原子核外電子由高能級回到低能級所產生的輻射，因此是冷光。熒光的顏色多為藍色、綠色、紅色和黃色等。

 

 

熒光檢測技術具有靈敏度高、特異性好、動態(tài)范圍寬、無放射性污染等優(yōu)點；但也易受到反應體系中PH值和環(huán)境溫度的影響，另外如熒光淬滅、光漂白等現象也會對熒光信號的檢測產生較大的影響。

 

我們可以根據熒光探針分子特性（半衰期不同）將熒光檢測技術分為熒光強度（FI）和時間分辨熒光（TRF）兩大類。

 

 

熒光強度即發(fā)射熒光的光量子數，熒光強度決定了熒光色素檢測的靈敏度。利用熒光強度進行物質定性：即不同的熒光物質有不同的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，因此可用熒光進行物質的鑒別。也可進行物質的定量測定：利用在較低濃度下熒光強度與樣品濃度成正比這一關系可以定量分析樣品中熒光組分的含量。熒光強度檢測技術在生物學上的應用非常廣泛，可以進行生物大分子定量、酶活性分析、熒光免疫分析、細胞學分析（細胞增殖、細胞毒理、細胞吸附等）、胞內鈣離子濃度的變化、熒光蛋白的報道基因分析 (GFP)、細胞凋亡等。

 

 

目前細胞增殖檢測普遍采用MTT方法，其原理是活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，DMSO溶解后，酶標儀在490nm波長處測定其光吸收值，此法可間接反映活細胞數量。但是其步驟比較繁瑣，且MTT對人有致癌性。所以熒光檢測方法以其自身許多優(yōu)點越來越得到大家青睞，以（Invitrogen）CyQuant細胞增殖檢測試劑盒為例,其為一種綠色熒光探針，能與細胞裂解液中的核酸特異結合,其檢測靈敏度可達50cell-50000cell/200ul，整個反應過程是免洗的，適合高通量實驗，并且不易受到細胞培養(yǎng)液中血清等成分干擾。

 

鈣離子是機體的重要元素，作為細胞內第二信使通過與鈣調蛋白結合激活多種蛋白激酶（如腺苷酸環(huán)化酶、磷酸二酯酶、鈣調蛋白激酶等）及諸多蛋白水解酶和核酸酶，從而參與包括細胞代謝、細胞周期等多種細胞功能的調節(jié)，在細胞的許多生命活動中擔當著重要的角色。傳統的 Fura-2，indo-1，Quin-2是Ca2+熒光指示劑，可以反映細胞內鈣離子濃度的變化，當結合鈣離子時，最大激發(fā)波長會發(fā)生改變，發(fā)射熒光的強度和結合的Ca2+濃度有著定量的關系，但是這些鈣流檢測試劑有其自身一些缺點，首先整個反應過程需要水洗，不適合高通量實驗要求，其二對溫度敏感，光穩(wěn)定性差。Molecular Devices針對于鈣流檢測特點推出了一系列檢測試劑盒，首先采用專利的quanch技術，整個反應過程不需要水洗，增加檢測通量，其次采用特殊的熒光探針，與鈣離子結合后其穩(wěn)定性較好，熒光信號強等優(yōu)點得到很多實驗者的肯定。

 

 

近幾年在生命科學研究中，GFP（一種水母中提取的綠色熒光蛋白）作為一種報告基因以其自身的許多優(yōu)點越來越受到大家重視，首先GFP無毒，自身在不需要輔酶作用下可以發(fā)光，且熒光信號穩(wěn)定。我們可以用目的基因與GFP基因融合，轉染細胞進行表達，通過熒光信號強弱來確定其表達量的高低。

 

 

時間分辨熒光（TRF）實際上是在熒光強度（FI）的基礎上發(fā)展起來的，它是一種特殊的熒光分析。熒光分析利用了熒光的波長與其激發(fā)波長的巨大差異克服了普通紫外－可見分光分析法中雜色光的影響，同時，熒光分析與普通分光不同，光電接受器與激發(fā)光不在同一直線上，激發(fā)光不能直接到達光電接受器，從而大幅度的提高了光學分析的靈敏度。但是，當進行超微量分析的時候，激發(fā)光的雜散光的影響就顯得嚴重了。因此，解決激發(fā)光的雜散光的影響成了提高靈敏度的瓶頸。

解決雜散光影響的最好方法當然是測量時沒有激發(fā)光的存在。但普通的熒光標志物熒光壽命非常短，激發(fā)光消失，熒光也消失。不過稀土元素（Eu、Tb、Sm、Dy)的三價離子的電子云的結構會一定程度上限制了電子的遷移，導致這類元素發(fā)生的熒光的衰減周期通常是很長，能達到1-2ms，可以滿足測量要求，因此而產生了時間分辨熒光分析法，即使用長效熒光標記物，在關閉激發(fā)光后再測定熒光強度的分析方法。平時常用于時間分辨熒光檢測的探針為Eu(銪）和Tb(鋱）。時間分辨熒光檢測技術具有靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好、檢測重復性好、操作流程短、標準曲線范圍寬等優(yōu)勢，適用于生物學、醫(yī)學免疫學的微量分析，如細胞因子檢測、抗體檢測、病毒抗原分析以及藥物代謝分析等。

隨著人們對食品安全的要求越來越高，國際社會上對食品中有毒有害物質的檢測越來越嚴格，各種有毒有害物質的限量標準也在不斷提高，時間分辨熒光免疫分析方法也可用于快速檢測食品中的大腸桿菌O157:H7、赭曲霉毒素A 、微囊藻毒素和有害金屬等。相信隨著多功能酶標儀廣泛的應用和各種檢測試劑盒的不斷開發(fā)，時間分辨免疫分析技術將在食品安全領域發(fā)揮更強大的作用。

 

 

綜上所述，利用熒光探針作為檢測手段具有很多優(yōu)勢，越來越多的基于其原理的檢測試劑盒問世。如何能更好的提高其檢測的靈敏度和線性范圍，降低其背景值，提高信噪比呢？

 

優(yōu)化檢測結果的關鍵技術之一，酶標儀的核心部件單色器，主要作用是從波長范圍寬廣的光線中，分出波段較窄的單色光的裝置。問世最早的是濾片型酶標儀，其配合二向色鏡（其實也就是另一模式的濾光反光濾鏡）等光路系統，可以滿足大部分實驗的需要。但是隨著實驗類型變化和檢測需求不斷提高，有時需要對激發(fā)和發(fā)射光譜進行研究，濾光片型酶標儀由于其濾片的數目限制，不能達到要求，故隨之誕生了光柵型的儀器。第一臺光柵型酶標儀是由Molecular Devices推出的，其在激發(fā)光和發(fā)射光處各有一個光柵，但是考慮到光純度不夠，所以在激發(fā)光柵和發(fā)射光柵的后面又加入了一組帶阻濾光片，對雜光進行二次過濾，其結果基本與純粹的濾光片系統一致。Molecular Devices的這項專利技術受到保護后，其它很多酶標儀廠家在光柵型酶標儀上面只能采用雙光柵系統來提高光純度，降低雜光率，即激發(fā)和發(fā)射各用了一組光柵，整個光路系統共四個光柵，所以也稱四光柵型酶標儀，雖然也能提高其對雜光過濾，但是由于多了一組光柵作用后，其光強度損失較大，檢測的靈敏度也會受到影響。

 

優(yōu)化檢測結果的關鍵技術之二，光源選擇，不同的單色器對光的透射率不同，會影響檢測靈敏度，那么光源本身強度高低也會對實驗結果產生很大的影響，目前酶標儀比較普遍使用的光源分別為普通氙閃燈、高能氙閃燈和鹵素燈等。LED燈作為一種新光源以其自身許多優(yōu)勢慢慢被許多酶標儀所采用，我們知道在同等效率下，LED燈壽命是傳統鹵素燈的10倍，免去了頻繁的更換燈泡和等待燈泡預熱所帶來的麻煩，其光源能量強、穩(wěn)定性好，所以有助于提高熒光檢測的靈敏度。

 

傳統酶標儀是采用光路系統和檢測器系統一體式設計模式，模塊出廠就已經固定，不可以進行功能上的升級。市場上需要一種用戶可根據自己的要求進行隨意升級的多功能酶標儀，Molecular Devices針對市場需求推出了一款名為Paradigm多功能酶標儀。它將光源系統和檢測系統獨立分開，多套檢測器固定在主機上，針對不同實驗要求選用不同的卡盒，每一種卡盒其實就是獨立的光路系統，例如光吸收實驗在波長靈活性上要求較高，那么針對這樣的要求，光吸收卡盒采用光柵作為其單色器；針對于AlphaSreen 要求的特殊性，卡盒也采用了激光作為其光源，保證了實驗數據的可靠性。

 

Tune卡盒的推出被認為是酶標儀發(fā)展技術上又一次劃時代的突破，它是集熒光強度、化學發(fā)光、時間分辨熒光三功能為一體的卡盒。首先它采用了高能AUTO-LED燈作為其光源，不但增加檢測靈敏度，而且還可以增加其檢測線性范圍，傳統酶標儀針對不同強度的熒光信號采用在PMT（光電倍增管）進行調節(jié)，熒光強度檢測線性范圍一般在4至5個數量級，采用了AUTO-LED燈可以使檢測動態(tài)范圍增加至6至7個數量級。其次它將兩種不同單色器的優(yōu)勢整合為一體，采用了一種全新的濾光片可調式技術，也就是既有光柵型單色器的靈活性（1nm光波可調），又保留了濾光片型單色器的光透率強的特點。這樣熒光強度和時間分辨熒光檢測實驗上，既增加其檢測的靈活性又增加檢測的靈敏度，有數據表明Tune卡盒在熒光檢測方面其靈敏度較光柵型單色器高10倍以上。

Molecular Devices一直以客戶需求作為其研發(fā)重點，Paradigm多功能酶標儀和Tune多功能卡盒的推出就很好的證明了這一點，針對未來不同實驗的不同要求，Molecular Devices將會推出針對其新檢測方法的卡盒來更好的滿足用戶的需要。