RNA探針的合成方法和合成效率檢測
RNA探針的合成方法和合成效率檢測
在RNA的雜交檢測實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用標(biāo)記的RNA 探針將獲得高靈敏度的雜交檢測結(jié)果，與DNA 探針相比，檢測靈敏度提高10-100倍。因?yàn)閷τ诓煌碾s交體類型來說，RNA-RNA雜交體的結(jié)合強(qiáng)度高于RNA-DNA和DNA-DNA雜交體。對于通過Northern blots檢測低濃度mRNA，以及原位雜交的核酸定位檢測等應(yīng)用，RNA探針是一種理想選擇。RNA探針同樣也適用于Southern blots，文庫篩選，斑點(diǎn)雜交等應(yīng)用。但是，在RNA探針制備過程和整個雜交實(shí)驗(yàn)過程中，必須注意RNAse的防污染操作。
制備RNA探針的常用方法是構(gòu)建含探針標(biāo)記模板的重組質(zhì)粒，將克隆子的轉(zhuǎn)錄區(qū)下游進(jìn)行限制性酶切線性化后，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄的探針合成反應(yīng)。當(dāng)然，采用的質(zhì)粒上必須含有SP6，T3或T7 RNA聚合酶的啟動子序列。體外轉(zhuǎn)錄法合成的探針量很大，通常情況下，1μg的DNA模板進(jìn)行反應(yīng)，將得到20μg的標(biāo)記RNA探針。
另一種更加直接的體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記法，是先通過PCR方法制備DNA探針模板。擴(kuò)增引物需要特殊設(shè)計，包含SP6，T3或T7 RNA聚合酶的啟動子序列。
對于原位雜交的應(yīng)用，為了更好地進(jìn)行雜交反應(yīng)的質(zhì)控，建議在制備反義鏈探針的同時，也制備正義鏈的探針，用作雜交實(shí)驗(yàn)的陰性對照。在原位雜交實(shí)驗(yàn)前，首先通過Northern blots實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探針的有效性和目標(biāo)轉(zhuǎn)錄子在不同樣本中的表達(dá)模式，有助于簡化后續(xù)原位雜交實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化流程和結(jié)果解釋。
模板制備和探針標(biāo)記
以地高辛（DIG）的探針標(biāo)記方法為例，羅氏DIG Northern Starter Kit的操作指南中建議，如果直接通過PCR方法制備DNA探針模板，反義鏈端的反向擴(kuò)增引物應(yīng)包括T7 RNA聚合酶的啟動子序列5'-AATACGACTCACTATAGG-3'（后續(xù)通過T7 RNA轉(zhuǎn)錄），或T3啟動子序列5'-ATTAACCCTCACTAAAGG-3'（通過T3 RNA轉(zhuǎn)錄）。
通過此方法獲得的特定PCR產(chǎn)物，無需經(jīng)過純化，即可用于下游探針合成。對于地高辛標(biāo)記系統(tǒng)，在體外轉(zhuǎn)錄合成的探針片段中，大約每隔3個UTP位點(diǎn)會插入一個DIG標(biāo)記的UTP分子（DIG-11-UTP）。核苷酸混合底物中未標(biāo)記UTP和DIG-11-UTP的比例很重要，因?yàn)樵谑褂玫馗咝量贵w進(jìn)行含DIG的雜交體的檢測時，探針上插入的DIG分子需排布在一個合適的空間位阻范圍，以利于抗體的順利結(jié)合，并獲得高靈敏度的檢測信號。
羅氏DIG Northern Starter Kit中提供理想濃度比例的含DIG-11-UTP的核苷酸混合底物。當(dāng)實(shí)驗(yàn)涉及的反義鏈探針的AU含量很高時，可通過加入未標(biāo)記dNTPs的方法，適當(dāng)調(diào)低DIG-11-UTP在核苷酸混合底物中的濃度。
探針標(biāo)記分析和靈敏度檢測
DIG標(biāo)記的RNA探針可以通過瓊脂糖凝膠電泳檢測其片段長度和純度。如未標(biāo)記的相同RNA序列比較，由于DIG分子的插入，被標(biāo)記的RNA將會在泳道中呈現(xiàn)分子量的變化。（圖1）
圖1：通過1.2%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證DIG探針標(biāo)記反應(yīng)的有效性。每個泳道的RNA加樣量為100ng。（數(shù)據(jù)來源于Roche Cancer Research Application Note No. 10, Weil et al., June 2011）
在進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)前，檢驗(yàn)所合成探針的靈敏度是非常重要的一個步驟，是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化和獲得可重復(fù)性雜交結(jié)果的前提。過高的探針濃度將引起高雜交背景，過低的探針濃度將使得雜交信號變?nèi)跎踔寥笔А?/DIV>
通過斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)可以驗(yàn)證DIG標(biāo)記探針的靈敏度（圖2）。將標(biāo)記好的探針進(jìn)行一系列的濃度梯度稀釋，點(diǎn)樣于陽離子尼龍膜上。同時，DIG Northern Starter Kit中提供有已知濃度的DIG標(biāo)記的β-actin RNA作為陽性對照。將樣品點(diǎn)樣并交聯(lián)在膜上后，直接進(jìn)行抗體結(jié)合和底物化學(xué)發(fā)光檢測（偶聯(lián)AP的地高辛抗體和CDP-Star化學(xué)發(fā)光檢測體系，均在試劑盒中提供）。DIG標(biāo)記的探針如在0.1pg的稀釋點(diǎn)處顯色，表明標(biāo)記探針的靈敏度十分理想。進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)的探針靈敏度應(yīng)至少達(dá)到1pg稀釋點(diǎn)的檢出，否則探針的靈敏度不足以獲得穩(wěn)定的雜交研究結(jié)果。
圖2： DIG探針標(biāo)記反應(yīng)的靈敏度檢測實(shí)驗(yàn)。顯色條件為羅氏化學(xué)發(fā)光試劑CDP-Star，曝光5min。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所有探針（除p53探針）均在0.1pg濃度處檢出。（數(shù)據(jù)來源于Roche Cancer Research Application Note No. 10, Weil et al., June 2011）
啟動子序列對探針標(biāo)記效率的影響
增加啟動子序列的長度將對探針標(biāo)記效率產(chǎn)生影響，獲得更高產(chǎn)量的探針（圖3）。如可將T3啟動子的序列增長為5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3'; T7啟動子的序列增長為5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3'。
圖3：T3/T7啟動子序列長度對探針標(biāo)記效率的影響。在基礎(chǔ)啟動子序列（啟動轉(zhuǎn)錄翻譯所需的最短序列）上附加4個堿基，可顯著增加探針的轉(zhuǎn)錄合成產(chǎn)量。（數(shù)據(jù)來源于Roche Cancer Research Application Note No. 10, Weil et al., June 2011）
羅氏地高辛產(chǎn)品系列廣泛應(yīng)用于核酸標(biāo)記和雜交檢測，具有高度靈敏、標(biāo)記檢測方便和探針可重復(fù)使用等特點(diǎn)。地高辛標(biāo)記的探針可在-15 ~ -25°C穩(wěn)定保存至少一年的時間。
DIG Northern Starter Kit是為DIG 系統(tǒng)初次使用者設(shè)計的試劑盒，試劑盒中包含了獲得成功、可重復(fù)的雜交檢測結(jié)果的所有必須試劑。該試劑盒以線性化DNA為模板，通過體外轉(zhuǎn)錄過程合成大量RNA轉(zhuǎn)錄本，RNA分子合成過程中摻入DIG-11-UTP底物，從而獲得DIG標(biāo)記的RNA探針。DIG Northern Starter Kit中的DIG Easy Hyb是專為地高辛雜交系統(tǒng)優(yōu)化的雜交緩沖液。在進(jìn)行雜交體檢測時，應(yīng)用試劑盒提供的偶聯(lián)有堿性磷酸酶（AP）的DIG抗體和CDP-Star化學(xué)發(fā)光底物，在短時間內(nèi)獲得高度靈敏、特異的雜交檢測結(jié)果。
配合使用DIG Wash and Block Buffer Set，能夠避免配制雜交過程中用到的洗滌和封閉緩沖液的麻煩，并有助于提高雜交檢測的質(zhì)量和重復(fù)性。
當(dāng)您對地高辛系統(tǒng)熟悉后，可根據(jù)您的研究需求靈活選擇地高辛RNA標(biāo)記反應(yīng)液（DIG RNA Labeling Mix）和試劑盒（DIG RNA Labeling Kit），及其他檢測系統(tǒng)（DIG Luminescent Detection Kit和DIG Nucleic Acid Detection Kit）。
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