適合HPLC餾分的一項先進的凍干技術

Rob Darrington，Genevac Ltd.，英國伊普斯威奇市

 

干燥高效液相色譜（HPLC）純化餾分（主要成分為水和乙腈）是眾多實驗室中一項常見且重要的實驗任務。實驗的要求是將樣品干燥成粉末狀，以便準確稱量樣品、進行二次取樣或再次溶解。因此，冷凍干燥是實驗的首選技術，但是常規(guī)的大型冷凍干燥系統(tǒng)可能難以處理有機溶劑，因為有機溶劑很容易在樣品中暴沸，并因此損壞真空泵，造成樣品損失。Actelion Pharmaceuticals采用Genevac公司¹ 開發(fā)的快速凍干法（LyoSpeed™），使用Genevac HT-12離心蒸發(fā)儀來完成這項工作。LyoSpeed方法通過離心機來控制樣品的沸騰情況，使有機溶劑濃縮，并避免樣品損失，然后從冷凝器中抽出有機溶劑，使剩余的水份凍干。這種方法對于親水性樣品而言非常有效，但如果樣品不能溶于水，已經去除有機溶劑的樣品將會潰散，甚至會形成油脂狀。這些樣品則需要更進一步的處理才能形成所需的干粉狀態(tài)。

 

標準化合物庫的平均操作成功率（完全凍干vs油性化合物）約為50％。根據化合物的不同屬性，最低和最高操作成功率可分別達到30％和90％。取得較高操作成功率的簡單方法，就是讓樣品凍干并使乙腈仍然保留在樣品中。遺憾的是，現有的設備還無法實現這樣的操作效果。

 

在硬件上也存在一定的限制因素，尤其是HT-12蒸發(fā)儀中溶劑冷凝器（VC3000）表現出的溫度特性。VC3000可以達到的最低溫度為-50°C，這就限制了蒸發(fā)系統(tǒng)可以達到的真空度。為了取得良好的凍干效果，真空度應盡可能低，最理想的狀態(tài)是能夠達到0.1mbar以下。例如，0.5mbar壓力條件下純凈水的沸點為-32℃，但乙腈在同等真空條件下的沸點可降至-61°C，因此會在煮沸時噴出冷阱和堵塞真空泵，導致蒸發(fā)系統(tǒng)中的壓力上升。壓力上升會提高溶劑的沸點，致使凍干效果不理想，甚至會導致凍干過程徹底失敗。使用LyoSpeed方法的目的不在于使樣品徹底凍干（如生產疫苗），而是要制出非油狀干燥粉末。正如真正的凍干過程一樣，只有實現更好的真空度，才能獲得更好的實驗結果。

 

 

問題的解決辦法很明確，即實驗室需要更能制冷的冷凝器，以便在低真空度條件下使樣品濃縮并保留住乙腈成分。 研究人員與Genevac公司的工程設計團隊合作，通過連接至HT-12蒸發(fā)器的VirTis Benchtop K -85°C冷凍干燥機 (BTK)，對 VC3000 冷凝器進行了一系列的基準測試。工作團隊根據相應的實驗結果，開發(fā)出了命名為VC6000（圖1）的HT-12新型冷凝器。 VC6000的設計根據BTK的構造演變而來，具有更強的冷凝功效、可縮短除霜時間，且具有Genevac系統(tǒng)耐溶劑性。

 

圖 1 – 連接VC6000冷凝器的Genevac HT-12蒸發(fā)系統(tǒng)

進行測試的Genevac HT-12蒸發(fā)系統(tǒng)與VC3000，BTK或VC6000冷凝器相連。10ml樣品成分為水和乙腈混合物（體積比為50:50），制備樣品的容器為直徑16mm高度100mm的玻璃瓶，管壁厚度為1.2mm。堅實的PVDF塑料樣品架放置于HT-12蒸發(fā)器的翼側，并裝有24支玻璃試管。每支玻璃試管中的溶劑成分為： 非化合物，或20mg Diovan或市售的20mg其他化學物質，以及親脂性材料鄰苯二甲-β-丙氨酸（AI028492）。Diovan和AI028482都是較難從HPLC餾分中凍干的樣品，因此這樣的組合形成了“最難處理”的樣品。在兩種負載情況下測試每一款冷凝器。一種情況采用4架樣品（96支試管），另一種情況采用12架樣品（滿載288支試管）。

 

所有樣品和每一款冷凝器都采用相同的方法：

1.    利用Dri-Pure®真空坡道控制樣品沸騰/暴沸情況，操作時長為 1小時

2.    無熱全真空處理，操作時長為3小時

3.    在40°C溫度條件下對樣品架進行全真空熱處理，操作時長為4小時

4.    全真空無熱處理，操作時長為18小時

第4階段的處理時間很長，采用這種方法進行測試，實際的干燥時間可由記錄的數據圖表獲取。

 

凍干之后，需要對每一試管中的化合物狀態(tài)進行評估，確定其是否已成功凍干為散干粉，或已經形成含有少量油質的樣品，或是每一試管中是否仍有殘余溶劑。 干燥時間可被視為溫度匯聚到樣品架和樣品上的時間。

圖 2– 每一測試條件下的凍干結果

Test System：測試系統(tǒng)

Number of Tubes: 試管數量

Compound: 化合物

Drying Time （Minutes）：干燥時間（分鐘）

Count of Condition of Sample after Drying : 干燥后的樣品狀態(tài)

Light Oily:少量油脂

 

如果凍干之后沒有發(fā)現殘余樣品，則達到100％的測試成功率。因此，放置于BTK的96份樣品中仍有2份樣品沒有干燥的實驗結果出人意料。由于此結果并未在較高樣品負載量的實驗條件下重復出現，因此沒有作出進一步調查，并將其視為異常實驗結果。

 

VC3000冷凝器處理實際樣品時的操作成功率最低。Benchtop K的操作性能更好，但因其內部容積過小而無法同時對288支試管進行凍干處理。VC6000冷凝器的操作性能最佳，這與預期的結果相一致。以下兩點值得注意：

1.    為什么附帶Diovan的VC6000冷凝器在樣品低負載量和高負載量兩種情況下表現出不同的操作性能？ 樣品低負載量情況下所需的干燥時間也更長，這與預計的結果截然不同。

2.    在每一項試驗中，處于每一位置的樣品成分完全相同，并且均取自同一儲備溶液，但為什么每支試管之間的干燥性卻如此不同？

 

查看實驗數據圖時（如圖3a和3b所示），可明確地找出使用VC6000進行兩項樣品（含Diovan成分）實驗得出不同結果的原因。圖3a顯示出較輕的樣品負載量，黃線表示樣品溫度，這不會與表示樣品架溫度的粉色線相交叉。這表明樣品仍然潮濕，如同實驗結果所示。 

圖 3a – VC6000冷凝器上帶有Diovan較輕樣品負載量（96個樣品）的數據圖

 

造成此實驗結果的原因無法立刻得知，從而需要作出進一步調查。其約1.5mbar的真空度不足使樣品凍結和完全干燥。導致問題的根本原因在于渦旋真空泵（Scroll pump）的性能略有下降。對于處理有機溶劑蒸汽的系統(tǒng)而言，渦旋泵（Scroll pump）無疑是最佳選擇，而且不會產生損壞真空泵的油脂。正如所有真空泵操作一樣，為了確保最佳的操作性能和取得最好的實驗結果，必須對泵進行定期維護。對于渦旋泵的日常維護，需要每隔3個月就檢查一下端部密封件，以確保性能良好、易于操作并且減少污染。

圖 3b – 帶Diovan的VC6000冷凝器上較高樣品負載量（288個樣品）數據圖

 

如果需要研究處理相同樣品的三種不同冷凝器的壓力曲線，只要在較高負載量中使用純溶劑，如圖4所示，功率更大更制冷的冷凝器（VC6000）能夠將壓力保持在較低水平，這表明冷凝器具有極強的冷凝溶劑 功能。實現成功的冷凍干燥，最重要在于保持所需的低壓條件，而決定這一條件的至關重要的兩個元素即好的真空度和功能強大并充分制冷的冷凝器。

 

圖 4 – 高負載量條件下3處冷阱的壓力性能數據圖

工作人員在每一項測試中都謹慎地使用潔凈的全新玻璃器皿、溶劑和樣品，因此可排除污染的可能性。對實驗結果的另一種解釋是，由于化合物本身在樣品表面形成了覆膜，因此可能阻礙或完全阻塞蒸發(fā)過程。冷凍干燥系統(tǒng)的使用者細致地描述了“濾餅阻力（cake resistance）”的概念，覆膜的厚度也可能隨著樣品深度的加大而增加。干燥化合物庫的實際研究結果顯示，樣品表面形成的覆膜會對干燥造成阻礙，以致會殘留幾毫升液體。樣品研究工作人員報告稱，具有特定化學性質的部分化合物庫在表面容易形成覆膜。對于使用AI02492（圖5）進行的實驗操作，少數樣品無法干燥的原因至今不明。雖然形成覆膜可能是導致此結果的一個原因，但這無法解釋為什么只有14份樣品無法干燥，而另外274份樣品則完全干燥。

 

圖 5 –高負載量試驗條件下使用AI02492 （連接VC6000）凍干后潮濕試管的位置

說明 – 黃色 = <0.5ml  紅色= <4.5ml  白色 = 干粉

 

 

 

實驗結果表明，相比測試所用的其他系統(tǒng)，VC6000具有更卓越的冷凍干燥性能（尤其是在高負載量情況下）。系統(tǒng)的真空度是取得良好實驗結果的關鍵因素，這需要一個密閉的真空系統(tǒng)和功能強大并且充分制冷的冷凝器。VC6000冷凝器已被用于執(zhí)行日常工作流程，在對于溶解方式高度變化（一些是在90%有機溶劑中洗脫，一些是在90%水中洗脫）的多種化合物構建的“真實化合物庫”來說，也會出現類似的蒸發(fā)實驗結果。甚至現在一些樣品是放置在鋁制樣品架進行處理，得到的實驗結果仍然是一樣的。

 

作者衷心感謝瑞士阿爾施維爾Actelion Pharmaceuticals公司化工部的高級實驗室研究人員Viktor Ribic，感謝他長久以來所做的研究工作，以及為本文提供寶貴的實驗數據。

 

1.  Developments in Laboratory Scale Lyophilisation for Purification Laboratories.  

Induka Abeysena 博士，Rob Darrington, 2006,可通過www.Genevac.com查閱

 

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