AlphaLISA篩選技術(shù)在SpectraMax Paradigm多功能檢測平臺上的應(yīng)用
Molecular Devices公司的SpectraMax® Paradigm®多功能檢測平臺是市場上唯一一個用戶可升級的微孔板檢測平臺，使用戶可以在不到兩分鐘內(nèi)對系統(tǒng)進行實時功能配置。如果需要使用Alpha技術(shù)，用戶可以在任何時候自己升級。SpectraMax Paradigm平臺能夠快速對TNF-alpha因子進行定量，通過對TNF-alpha刺激的人內(nèi)皮細胞中細胞因子的定量實現(xiàn)抗炎代謝產(chǎn)物的高靈敏篩選。
AlphaLISA®是一種基于微珠的均相檢測技術(shù)，用于在微孔板中研究分子之間的相互作用�？梢杂糜诩毎蜃拥亩恳约昂Y選具有抗炎活性的化合物。和傳統(tǒng)的ELISA方法相比，ELISA需要多次洗滌步驟，而洗滌操作可能破壞貼壁的細胞。AlphaLISA無需洗滌，減少細胞損失，使實驗結(jié)果SD值更小，數(shù)據(jù)更加準確。
TNF-alpha純化和定量
首先，需要獲得純化的TNF-alpha蛋白，用于刺激內(nèi)皮細胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。為此目的，人TNF-alpha因子在Pichia pastoris酵母中進行表達。使用酵母的好處是既可以表達大量的重組蛋白又不會產(chǎn)生干擾細胞水平實驗的內(nèi)毒素。我們可以從每升酵母培養(yǎng)物中純化獲得10-20mg具有生物活性的蛋白。SpectraMax Paradigm平臺使用AlphaLISA方法可以定量低至pmol級的蛋白（圖1）。使用軟件內(nèi)置的經(jīng)過優(yōu)化的檢測程序，可以在2分鐘內(nèi)完成384孔板的檢測。
然后，我們開發(fā)出一個AlphaLISA分析方法，用于檢測內(nèi)皮細胞經(jīng)過TNF-alpha刺激后產(chǎn)生的促炎癥因子的水平。使用上面純化的人重組TNF-alpha蛋白處理人肺微血管內(nèi)皮細胞（HLMVEC）誘導細胞間粘附因子1（ICAM-1）表達。在孵育處理18小時后ICAM-1被上調(diào)表達。使用AlphaLISA對ICAM-1的表達水平進行定量（圖2A）。
內(nèi)皮細胞經(jīng)過TNF-alpha或LPS刺激后，表達分泌IL-8。IL-8是一種中性白細胞的趨化蛋白，而中性白細胞可以在體內(nèi)浸潤發(fā)炎的組織。因此，對內(nèi)皮細胞分泌的IL-8進行定量，可以提供很有價值的在體外血管內(nèi)皮細胞促炎癥反應(yīng)狀態(tài)信息。為了評估分泌的IL-8水平，我們使用AlphaLISA分析了經(jīng)過處理的HL-MVEC細胞培養(yǎng)上清樣品（圖2B）。
ICAM-1和IL-8在HL-MVEC內(nèi)表達上調(diào)（圖2）
TNF–alpha處理細胞18小時后，使用SpectraMax Paradigm平臺的AlphaLISA方法檢測 HL-MVEC細胞內(nèi)ICAM-1 (A) 和IL-8 (B) 的上調(diào)水平。
基于內(nèi)皮細胞篩選鑒定抗炎化合物
藍藻是一種藍綠色藻類，它具有非常多樣的代謝產(chǎn)物。其中一些代謝產(chǎn)物具有很好的治療前景，目前正在研究用于治療炎癥疾病。1,2,3我們使用上面描述的方法從藍藻中篩選具有抗炎癥的化合物。HL-MVEC預(yù)先使用從Nostoc藍藻中提取的不同組分進行處理，然后使用0.4ng的人TNF-alpha蛋白進行刺激。18個小時后，在SpectraMax Paradigm平臺上使用AlphaLISA技術(shù)檢測得到ICAM-1得以上調(diào)表達，然后對細胞培養(yǎng)上清進行進一步分析IL-8的水平。我們發(fā)現(xiàn)藍藻8721,6組分（圖3）可以顯著降低ICAM-1的產(chǎn)生，顯示出抗炎癥活性。這個組分也明顯降低IL-8的表達分泌（數(shù)據(jù)未給出）。在進行AlphaLISA檢測前，也對組分進行了細胞毒性檢測，顯示其細胞毒性作用很小，可以忽略。
藍藻中抗炎活性成分的篩選（圖3）
使用AlphaLISA分析藍藻中各組分的ICAM-1上調(diào)效應(yīng)。組分8721,6可以顯著降低ICAM-1的表達生成。
總結(jié)
SpectraMax Paradigm平臺聯(lián)合AlphaLISA提供了一個強有力的工具，可以使用基于內(nèi)皮細胞、病理相關(guān)的模型篩選新型的治療藥物。高靈敏度、高速度、高達1536孔板的兼容性以及內(nèi)置的預(yù)先優(yōu)化的檢測程序，使用戶操作更簡單、運行更快速。SpectraMax Paradigm是你使用Alpha技術(shù)篩選藥物的最好選擇。
致謝
最后我們要感謝Maren Plüger Anita Eigner、Maria Hirschler、Linda Kotnik、Katrin Fuchslueger、Julia Schweiger、Christoph Wiesner、Andreas Eger、Wolfgang Schütt以及IMC大學的Harald Hundsberger、Czech 科學院的Jiri Kopecky，感謝他們慷慨提供數(shù)據(jù)。
參考資料
1. Rasool, M.; Sabina, E. P.; Lavanya, B. Biol Pharm Bull 2006,29(12), 2483
2. Romay, C.; Armesto, J.; Remirez, D.; Gonzalez, R.; Ledon, N.; Garcia, I. Inflamm Res 1998, 47(1), 36.[31]
3. Prinsep, M. R.; Thomson, R. A.; West, M. L.; Wylie, B. L. J Nat Prod 1996, 59(8),
