基于數(shù)字PCR的單分子DNA定量技術(shù)研究進展
基于數(shù)字PCR的單分子DNA定量技術(shù)研究進展
李亮1)隋志偉1)王晶1)臧超1)余笑波2)
（1)中國計量科學(xué)研究院，北京100013 ；2)浙江省計量科學(xué)研究院，杭州310013)
摘要 數(shù)字PCR是一項針對單分子目標DNA的絕對定量技術(shù)。該技術(shù)是將含有DNA模板的反應(yīng)溶液分配到大量獨立的反應(yīng)室中并且發(fā)生擴增反應(yīng)，通過統(tǒng)計反應(yīng)室中的陽性信號來定量DNA的拷貝數(shù)。DNA樣品在反應(yīng)室中隨機和獨立分布是單分子成功擴增和準確定量D NA拷貝數(shù)的關(guān)鍵因素。本文綜述了數(shù)字PCR的發(fā)展歷史、數(shù)字PCR與實時熒光定量P CR的區(qū)別，以及數(shù)字PCR在臨床診斷、轉(zhuǎn)基因成分定量、單細胞基因表達、環(huán)境微生物檢測和下一代測序等方面的最新進展，并展望了該技術(shù)的應(yīng)用前景
關(guān)鍵詞 數(shù)字PCR，絕對定量，實時熒光定量PCR，拷貝數(shù)，單分子。
核酸的序列、多樣性和豐度分析是現(xiàn)代生物學(xué)的基礎(chǔ)。核酸定量技術(shù)在診斷和個體化醫(yī)療、食品檢驗和轉(zhuǎn)基因生物檢測、病原體鑒定、法醫(yī)科學(xué)等方面已被廣泛應(yīng)用，同時這些應(yīng)用也推動了核酸定量技術(shù)的進步。
DNA分子擴增技術(shù)的應(yīng)用促進了分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展[2]。精確定量 DNA 拷貝數(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的重要應(yīng)用之一。數(shù)字PCR(digital polymerase chain reaction，dPCR)作為 DNA 定量的新技術(shù)，克服了實時熒光定量PCR (real timequantitative PCR，qPCR)的一系列缺點，實現(xiàn)了單分子 DNA 絕對定量。dPCR是將單個 DNA 樣品反應(yīng)液分別進行數(shù)以百計的反應(yīng)，并且每個反應(yīng)分別進行擴增檢測。dPCR是 DNA 絕對定量方法，解決了qPCR 所用的標準曲線對測量結(jié)果產(chǎn)生影響等問題，并可減少 qPCR 帶來的基體效應(yīng)。此技術(shù)在臨床診斷、轉(zhuǎn)基因成分定量、單細胞基因表達、環(huán)境微生物檢測和下一代測序等方面的研究發(fā)揮了重要作用。
1 dPCR技術(shù)發(fā)展歷史
1992年，Sykes 等報道了基于樣品稀釋和泊松分布數(shù)據(jù)處理的巢式PCR定量技術(shù)，并提出了數(shù)字PCR的構(gòu)想。1997年，Kalinina 等使用玻璃毛細管進行了微升(μl) 級的PCR反應(yīng)，通過熒光探針收集到基因組DNA的單分子信號，進而發(fā)展了單分子定量技術(shù)。1999年, Vogelstein 和Kinzler基于以上報道采用96孔板系統(tǒng)發(fā)展了微升級的PCR擴增方法，用于結(jié)腸癌的致癌突變基因ras 的定量分析。隨之，Dressman 等發(fā)明了一種BEAMing方法( 珠子、乳劑、擴增與磁力)：將鏈霉親和素與磁珠共價結(jié)合，磁珠外包裹一層生物素的PCR引物，進行擴增反應(yīng)。反乳化作用后，使用流式細胞儀通過磁珠分析等位基因變異。盡管步驟較多，該技術(shù)仍不失為廣泛應(yīng)用于實驗室定量DNA的理想方法，可以用來檢測和定量單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP) 或突變等核酸序列變異及含有變異等位基因的磁珠能夠被流體分離排序，因而可應(yīng)用于樣品測序等序列分析。
盡管dPCR技術(shù)具備廣闊應(yīng)用前景，但由于96孔或384 孔平板加樣的復(fù)雜操作為精確測量帶來了困難，也難以解決高通量測量問題。微流體的出現(xiàn)和納升(nl) 反應(yīng)儀器的開發(fā)克服了這些技術(shù)的瓶頸。在2003年，Liu等使用微流體的概念，在微流體芯片上進行了400 個獨立的3nl PCR反應(yīng)。2008 年，嵌入式芯片的PCR 反應(yīng)次數(shù)達到了9180 個6nl 的PCR平行反應(yīng)。例如，F(xiàn)luidigm公司的Biomark 系統(tǒng)，此系統(tǒng)微流體dPCR芯片由12個獨立的微流體面板(panel) 和相應(yīng)進樣孔組成(圖1). 每個面板含有765 個6nl 的獨立反應(yīng)室(partition)。4.6μl反應(yīng)液通過進樣孔進入后被分配到765個反應(yīng)室進行獨立擴增。該技術(shù)在日趨完善的同時，單次的反應(yīng)數(shù)和檢測精度成為此項技術(shù)研究的重點。最近，Heyries 等報道了一個百萬級的微流體dPCR裝置，成為了dPCR技術(shù)的又一重大突破。該裝置通過表面張力以達到樣品分布和疏水控制，提高了單分子DNA擴增的保真性，每皮升( pl) 進行100萬個反應(yīng)，達到每平方厘米(cm2) 44萬個反應(yīng)。這種裝置可實現(xiàn)每10萬個野生型序列中低于一個變異拷貝的檢測。
圖1 微流體dPCR的12×765 反應(yīng)芯片
2 qPCR與dPCR比較研究
qPCR是目前DNA定量研究的主要技術(shù)，該技術(shù)通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光結(jié)合染料(SYBR green I) 或熒光標記的探針( 如TaqMan Probes) ，利用實時積累的熒光信號監(jiān)測整個擴增過程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析，以此來評估PCR的擴增效果。qPCR主要依賴于校準物制備的標準曲線，進而確定未知樣品的濃度，因此是一種相對定量的方法。該技術(shù)存在以下問題：a、校準品和樣品間背景的不同將引入偏差，并且影響PCR的效率和測量響應(yīng)；b、低拷貝數(shù)的目標 DNA分子不能通過擴增檢測到；c、樣品的PCR擴增效率可能與校準物的擴增效率不同；d、DNA提取時引入DNA溶液的雜質(zhì)或者DNA降解影響了PCR動態(tài)擴增過程。
dPCR是一項檢測和定量核酸的新技術(shù)。它不同于傳統(tǒng)的qPCR，因為采用直接計數(shù)目標分子數(shù)而不依靠任何校準物或外標，dPCR通過計數(shù)單個分子從而實現(xiàn)絕對定量。dPCR將傳統(tǒng)PCR的指數(shù)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號，僅僅通過顯示程序設(shè)定的循環(huán)數(shù)后擴增是否發(fā)生，即可克服上述困難，達到核酸的絕對定量。dPCR在進行擴增反應(yīng)前，將含有DNA模板的PCR溶液稀釋后分布到大量的獨立反應(yīng)室(圖2) ，單分子間通過稀釋分離，并且獨自進行PCR擴增，最后分析每個擴增產(chǎn)物。這實現(xiàn)了通過先于PCR擴增的樣品分離。這種樣品的分配可以消除本底信號的影響，提高低 豐度靶標的擴增靈敏度，簡單計算出DNA的模板拷貝數(shù)而不需要采用參考標準物或者外標。準確的定量依賴于40～45個循環(huán)的擴增，錯誤的陰性檢出水平(單DNA模板出現(xiàn)在反應(yīng)室而未被檢出) 非常低。數(shù)字PCR是一項具有可重復(fù)性的定量微量DNA分子的優(yōu)良技術(shù)。其操作方便、檢測通量高、特異性強、靈敏度高、定量準確等優(yōu)點使其成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具。
圖2 dPCR擴增反應(yīng)原理
3 dPCR應(yīng)用研究
3.1 dPCR在臨床診斷方面的研究
dPCR應(yīng)用于癌癥的等位基因突變和拷貝數(shù)變異等方面的檢測研究，為癌癥檢測提供了新的診斷工具。Oehler 等對慢性白血病的相關(guān)基因ABL酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域突變采用了dPCR進行絕對定量檢測，并且建立了同時檢測多個ABL酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域突變的方法。表皮生長因子受體( epithelial growth factor receptor ，EGFR) 突變或過表達一般會引發(fā)腫瘤。Yung 等開發(fā)了一種關(guān)于非小細胞性肺癌患者血漿和腫瘤中的兩種EGFR突變體( 第19外顯子內(nèi)缺失和第21外顯子L858R 突變) 的dPCR定量檢測方法。第19外顯子內(nèi)缺失和第21外顯子L858R突變占酪氨酸激酶突變響應(yīng)的85% 以上。實驗結(jié)果表明這兩種突變在預(yù)治療的35個血漿樣品分別檢出6個(17%)和9個(26%)。與腫瘤細胞的測序結(jié)果相比，血漿EGFR突變的靈敏度和特異性是92% 和100%。在腫瘤和血漿中的低豐度EGFR突變通過微流體dPCR靈敏檢測和精確定量將應(yīng)用于預(yù)測治療反應(yīng)、監(jiān)控疾病進展和早期檢測獲得性耐藥等方面研究。
高通量基因分型驗證與疾病相關(guān)的SNPs研究促使研究者采用一項新的技術(shù)，dPCR，對外周血液及口腔洗液提取DNA的基因分型進行評價分析。利用基于BioMark PCR平臺的Fluidigm 48×48動態(tài)陣列生物芯片進行SNP基因分型。共90個樣品與20個SNP的體系對比，分別得到平均99.7%以及16個體系100% 的結(jié)果。TaqMan 基因分型與三組SNP進行對比得到了100%的相關(guān)性。為了研究DNA模板變化的影響，血液樣品( CH-1，n=20；CH-2，n=47；KK，n=47)和口腔洗液( n=37) 通過24個SNPs 進行基因分型。CH-1 和CH-2 批次顯示了很好的基本響應(yīng)(≥98.8%)，KK批次和口腔洗液樣品響應(yīng)較低(82.1% 和94.0 %)。但經(jīng)再純化后的KK和口腔洗液樣品結(jié)果響應(yīng)率有顯著提高( 逸98.8% ).研究結(jié)果表明dPCR的準確度與TaqMan 基因分型類似，但DNA用量更少，節(jié)省了更多的人力、時間及成本。
拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV) 是人類遺傳變異的重要來源，并且與大量的人類疾病密切相關(guān)。Qin等采用dPCR 系統(tǒng)精確定量了DNA樣品的拷貝數(shù)，建立了dPCR的分析模型，并且進行了以下3個方面的研究：a、在一系列人類基因組和合成的RPP30基因中定量了RPP30基因的拷貝數(shù)，與預(yù)期結(jié)果相符；b、研究了商品化樣品中的CYP2D6基因拷貝數(shù)，與傳統(tǒng)手段定義的拷貝數(shù)一致；c、通過對ERBB2 基因的擴增篩選到了40個乳腺癌樣品，與文獻報道的基本一致。這項研究表明，dPCR為特異性CNV 的研究供了一個新的、精確的和強有力的技術(shù)支持。
孕婦血漿中的胎兒游離核酸(DNA和RNA檢測開啟了無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的新領(lǐng)域，補充了唐氏綜合癥(非侵入性染色體異倍體) 產(chǎn)前診方法。基于胎兒核酸的精確dPCR方法推進了此研究領(lǐng)域的發(fā)展，為孕婦及胎兒提供更安全診斷。在2007年，Lo等在證明了dPCR 可用于孕婦血漿RNA- SNP等位基因比率的測量后，應(yīng)用該方法從整倍體胎盤DNA 樣品中鑒別出21個三倍體樣品。Lo等進一步證明：即使三倍體DNA以小量片段存在時，異倍體也能被檢測到。后者對于針對母親血漿建立的三倍體檢測方式是十分必要的。Fan和Quake后續(xù)發(fā)表的文獻也支持了這個觀點。隨后，Lo等針對以蛋白質(zhì)- RNA 復(fù)合物方式存在于血漿中的胎兒游離RNA進行了研究。比較了質(zhì)譜和dPCR對孕婦血漿中PLAC4基因的mRNA-SNP比率，其中質(zhì)譜的臨床靈敏度為90%，臨床特異性為96.5%，dPCR的臨床靈敏度和特異性均為100%。近期研究表明，與質(zhì)譜檢測和qPCR相比，dPCR可以獲得更精確的定量結(jié)果。故此，dPCR檢測胎兒DNA的濃度可能要高于預(yù)期。微流體芯片dPCR的快速發(fā)展，已成為目前臨床應(yīng)用最具潛力的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)，并為其在常規(guī)檢查中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
3.2 dPCR在轉(zhuǎn)基因植物檢測方面的研究
轉(zhuǎn)基因植物及相關(guān)食品的定量分析主要測定轉(zhuǎn)入基因的相對含量。目前常用qPCR作為核酸定量方法。dPCR可以不需要校準物而準確測量低拷貝的DNA分子。Corbisier 等用dPCR分析了提取于MON810玉米種子的外源檢測基因和hmg基因的拷貝數(shù)，驗證了dPCR的絕對拷貝數(shù)比例定量結(jié)果和質(zhì)粒DNA做標準物質(zhì)qPCR相對定量比率一致。因此提出dPCR具有計量特性，可以用來測量轉(zhuǎn)基因相關(guān)標準物質(zhì)的D NA拷貝數(shù)比率。
單分子擴增效率對于改善總DNA片段的拷貝數(shù)和短片段完整DNA的估計偏差有顯著意義。目標DNA分子在反應(yīng)室的隨機和獨立分布是dPCR準確定量的關(guān)鍵。Bhat 等認為，反應(yīng)室的容量是不確定度的主要來源，并且評定的相對不確定度在6%以下。這項發(fā)現(xiàn)可以用于其他dPCR測量的置信水平研究。隨后，Burns 等采用經(jīng)驗證的檢測轉(zhuǎn)基因成分的qPCR反應(yīng)體系，評估了dPCR技術(shù)的絕對檢測限和定量限，也闡述了采用梯度預(yù)實驗的方式可以使dPCR更精確地測量拷貝數(shù)。經(jīng)過30個平板重復(fù)后，實驗結(jié)果表明在每個平板發(fā)生200 ～700個反應(yīng)是最為精確的，這和儀器廠商的推薦是一致的。
3.3 dP CR在單細胞基因表達方面的研究
將dPCR 技術(shù)用于單細胞基因表達研究是dPCR技術(shù)發(fā)展的里程碑。White 等設(shè)計開發(fā)了一種能夠高精度測量單細胞中數(shù)以百計的基因表達的dPCR設(shè)備。此設(shè)備可進行包括細胞獲取、裂解、反轉(zhuǎn)錄和定量PCR等單細胞加工處理。此外，為了提高通量，降低成本，White 等采用微升體積處理減少了測量噪音，增加了靈敏度，提高了單核苷酸的特異性。并且應(yīng)用這項技術(shù)測定了3300個單細胞，包括：a、miRNA在K562 細胞的表達；b、miRNA及其目標轉(zhuǎn)錄子在胚胎細胞分化時的協(xié)同作用；c、乳腺癌細胞的單核苷突變檢測等，建立的核心功能提供了多種基于芯片系統(tǒng)的單細胞轉(zhuǎn)錄分析。
Spurgeon等報道了基于微流體dPCR的高通量基因表達平臺。此平臺同時對2304個基因進行擴增反應(yīng)，與96孔板相比需要更少的上樣量。在單芯片上還可以檢測18個組織中的45個不同基因。實驗結(jié)果與傳統(tǒng)的qPCR十分吻合，并且同商業(yè)化的DNA芯片相比具有更好的重復(fù)性。Warren等報道了數(shù)字RT-PCR微流體芯片可實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子表達數(shù)量的系統(tǒng)定量分析，并且可以計算源自單細胞的cDNA樣品。在一個包括早期5 級造血前體的研究中，Warren 發(fā)現(xiàn)造血干細胞中轉(zhuǎn)錄因子PU1表達顯著變化，在flk2-和flk2+骨髓祖細胞中PU1表達呈多樣性。
最近，Guo等采用dPCR技術(shù)研究了受精卵到囊胚的單細胞基因表達。利用單細胞表達分析，對小鼠囊胚中64細胞期3 種不同細胞類型的500個細胞分化到此階段進行了研究�；�800余個轉(zhuǎn)錄子的全胚胎分析，選擇了48個基因進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 種細胞類型可以利用定量表達方法進行明顯的區(qū)分。最后分別確定ID2和Sox2為細胞外和細胞內(nèi)最早的標記物。進而對早期內(nèi)細胞受體配合對Fgfr2/Fgf4 進行負相關(guān)表達分析。定位與信號傳遞發(fā)生在轉(zhuǎn)錄活動成熟之前。結(jié)果表明單細胞表達分析能夠深入研究細胞的發(fā)育機制，應(yīng)將這項技術(shù)推廣應(yīng)用于更廣泛的生物系統(tǒng)中。
3.4 dP CR在環(huán)境微生物方向的研究
dPCR技術(shù)高通量擴增和分析的優(yōu)點使同時研究自然界的多個細菌單細胞的多個不同基因得以實現(xiàn)。Ottesen 等使用一個在白蟻和其腸道菌群相關(guān)的多級關(guān)鍵酶基因作為誘餌，采用dPCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)了未知的核糖體RNA。這種技術(shù)能夠系統(tǒng)地鑒定復(fù)雜生態(tài)環(huán)境中攜帶目的基因的細菌，并根據(jù)一兩個目的基因追溯到其種屬，因此，dPCR將為環(huán)境研究領(lǐng)域提供新的契機。
病毒可能是地球上存在量最大的生物物種。然而，對于大多數(shù)病毒的寄主，卻鮮有基因組學(xué)或經(jīng)典的階段劃分技術(shù)對其進行研究。Tadmor 等采用dPCR方法，通過一個病毒標志基因?qū)渭毦毎c自然環(huán)境相關(guān)聯(lián)。應(yīng)用這項技術(shù)對白蟻后腸微生物群落的研究發(fā)現(xiàn)在屬的范圍感染模式間，存在著巨大的屬內(nèi)選擇性。病毒標志物顯示了宿主間嚴格的等位基因混合，揭示了除鄰近宿主外的等位基因橫向基因轉(zhuǎn)移的限制程度。方法無需培養(yǎng)宿主細胞或病毒，為許多環(huán)境細菌與病毒的相互作用提供了有效方法。
3.5 基于dPCR的單分子測序技術(shù)研究
自從2003年單分子測序技術(shù)應(yīng)用到測序領(lǐng)域后，此類技術(shù)的各類形式相繼報道，并且以每年10倍通量高速增長。
dPCR為高通量測序提供了靈敏的和絕對的校準。下一代測序(next generation sequencing, NGS)如454，Solexa 和SOLiD平臺需要通過測序校正分子數(shù)量。此條件存在兩種不利后果：a、大量微克級的樣品需要制備為文庫，因此限制了可測序樣品的范圍。對多數(shù)應(yīng)用來講，包括宏基因組、考古學(xué)樣品、法醫(yī)樣品和臨床樣品測序，DNA的樣品量是非常有限的。b、每個文庫需要滴定法測序，因此增加了成本, 降低了測序的通量. 為此, 使用dPCR精確定量454 和Solexa 測序文庫，使測序文庫的制備達到納克級，同時消除了花費在儀器滴定的成本和時間。同時成功地對454 FLX 和Sole xa測序平臺的低于納克級的細菌和哺乳動物的DNA樣品進行了測序。White 等的研究結(jié)果首次明確證明了基于454 平臺的皮克級DNA樣品的測序，對DNA樣品的需求量在無預(yù)擴增時降低了1000 余倍。dPCR實現(xiàn)了測序文庫的絕對定量，消除了構(gòu)建和PCR定量標準曲線等不確定因素，相對標準偏差低于10% ，在無滴定情況下，足夠滿足直接測序的精度要求。
ABCA4基因突變或等位基因不一致可引起多種疾病。Zernant 等為尋找ABCA4疾病的相關(guān)變異基因，研究了168 例醫(yī)學(xué)診斷為黃斑病變、視錐-視桿營養(yǎng)不良或其他ABCA4疾病表型的患者。首先使用ABCA4芯片篩選基因突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)111 例病人中有1 例病人有2 個預(yù)期的突變，57個病人中沒有，隨后應(yīng)用dPCR和454 測序平臺鑒定了新變異結(jié)果，分析了這些致病性的原因。在已鑒定單一位點突變的103 例病人中，鑒定了第二疾病相關(guān)等位基因49例。雖然編碼 ABCA4基因的眾多突變?nèi)匀晃粗�，并且許多位于ABCA4的非編碼區(qū)，但是ABCA4實驗結(jié)果是一個較好的選擇方法，NGS 平臺對于篩選大量的疾病是一個在時間和消費方面都高效的工具。
NGS 是一種識別和確認未知致病菌的前景廣闊的技術(shù)，然而其在生物防御和公共健康應(yīng)用等方面的時效性，卻往往因為缺乏快速、有效、可靠的自動DNA樣品制備方法而受到限制。為了突破這種限制，Kim 等設(shè)計了一種基于流體分布元件的數(shù)字微流體(DMF) 平臺，使得多子系統(tǒng)模塊能夠進入自動NGS庫樣品制備系統(tǒng)。通過一種新型毛細管接口，可以實現(xiàn)液體在DMF設(shè)備與外部流體模塊間的高重復(fù)性轉(zhuǎn)移，使得流路連續(xù)，且小滴樣品能夠在一個完整的系統(tǒng)內(nèi)得到處理。這里，該技術(shù)強調(diào)了DMF元件平臺和NGS 樣品制備流程中自動運行毛細管接口的效用。將毛細管接口與一種嵌入式非接觸電導(dǎo)檢測器連接，DMF設(shè)備實現(xiàn)了目標分析物從樣品流到小液滴的閉環(huán)自動片段采集。NGS 中重復(fù)次數(shù)最多的緩沖液交換與樣品清洗通過使用一種磁珠解決，實現(xiàn)了DMF平臺上平均DNA回收率為(80±4.8)%。
先天性糖基化缺陷是由于機體缺少糖基化作用，主要影響到N 相關(guān)途徑造成的。至少40% 的先天性糖基化缺陷病人在診斷過程中沒有得到分子水平的確認。Jones 等通過已經(jīng)導(dǎo)致先天性糖基化缺陷基因的下一代測序驗證的研究，從分子水平提高了診斷先天性糖基化缺陷的水平。12例未知樣本致病突變的先天性糖基化缺陷病人作為陽性對照進行NGS驗證，分別采用RainDance 與Fluidigm 平臺( dPCR) 進行序列富集和目標擴增，SOLiD平臺用于測序和擴增產(chǎn)物。進而通過NextGENe 進行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，12個陽性對照的致病突變通過NGS都得以確認。在病人診斷過程中，NGS的發(fā)展使實驗室診斷多基因與分析逐個基因相比成本消耗更低、速度更快、效率更高。臨床實驗室的下一代測序數(shù)據(jù)分析結(jié)果同樣支持這項技術(shù)，推廣使用這項技術(shù)至關(guān)重要。
4 總結(jié)與展望
生物學(xué)的基礎(chǔ)研究和分子技術(shù)的前進伴隨著更精確和更靈敏的測量技術(shù)發(fā)展。值得一提的是，dPCR具有測量獨立性與無需任何校準物的特點。因此，該技術(shù)是潛在的核酸測量基準方法，并從原理上為核酸計量提供了保證。相比其他方法，dPCR作為絕對定量方法能準確定量目標DNA和提供可靠的定量數(shù)據(jù)。商業(yè)化dPCR 儀器( 如Fluidigm 公司的BioMark System)的大量出現(xiàn)進一步推動和擴大了該技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用范圍。
dPCR技術(shù)及其應(yīng)用凸顯了單分子定量技術(shù)的潛力。不久，微流體dPCR就會突破反應(yīng)速度和體積的限制，實現(xiàn)自動化和高通量的應(yīng)用。核酸測序?qū)⑹腔赿PCR的單分子擴增技術(shù)最重要的應(yīng)用領(lǐng)域。dPCR的克隆擴增可以減少下一代測序的時間和成本，并使個人基因組測序得以實現(xiàn)。我們期望在不遠的將來，這項技術(shù)的發(fā)展將對單分子核酸擴增領(lǐng)域產(chǎn)生深遠影響，在分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等基礎(chǔ)研究和應(yīng)用方面發(fā)揮更大的作用。
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