一種針對細(xì)胞表面受體進(jìn)行抗體篩選的多重分析方法[創(chuàng)新技巧]

    本文以人EGFR抗體與細(xì)胞表面EGFR抗原結(jié)合為例，描述TTP Labtech的mirrorball儀器作為一種“mix-and-read”方法在在抗體篩選中的應(yīng)用。EGFR配體的蛋白家族參與了細(xì)胞遷移，粘附和分化等活動，包括乳腺癌，肺癌，結(jié)腸癌在內(nèi)的許多疾病都和EGFR的過度表達(dá)有著密切的關(guān)系。

    不同靶蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴大，可以用于不同疾病的治療和診斷（譬如癌癥，自身免疫性疾�。�。單克隆抗體是特定細(xì)胞系針對特定抗原的分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中的生物蛋白，而高通量篩選是抗體開發(fā)的重要組成部分。

ELISA和Mix-and-read

    利用傳統(tǒng)ELISA技術(shù)在進(jìn)行抗體篩選時有許多局限性，由于ELISA技術(shù)依賴于微孔板上包被的抗原，所以該方法不適合檢測低溶解性的抗原（譬如細(xì)胞表面受體）。由于ELISA的操作方式，使得ELISA很難進(jìn)行識別細(xì)胞表面抗原天然構(gòu)象的抗體的篩選。即使對于可溶性抗原抗體篩選，由于微孔板對檢測抗體的吸附從而改變蛋白構(gòu)象，繼而無法識別抗原特定抗原表位。

    一種“mix-and-read”分析方法在生物制藥行業(yè)的單克隆抗體篩選領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。這種”mix-and-read”分析方法是將所有分析組分加到一個孔中，繼而孵育從而使得結(jié)合達(dá)到平衡。對于抗體篩選，該方法可以利用包被抗原的珠子或者表達(dá)抗原的細(xì)胞進(jìn)行分析，抗原抗體的相互作用可以通過結(jié)合在珠子或者細(xì)胞的熒光標(biāo)記的偶聯(lián)物的熒光強度進(jìn)行檢測。結(jié)合的熒光可以利用細(xì)胞技術(shù)儀無需洗滌進(jìn)行分析，以達(dá)到區(qū)分測試孔中結(jié)合和游離的熒光。Lee等在發(fā)明FMAT時，詳細(xì)介紹了相比傳統(tǒng)ELISA方法細(xì)胞計數(shù)儀的優(yōu)勢。相對于傳統(tǒng)的ELISA分析方法，利用該技術(shù)分析“mix-and-read”實驗可以提高檢測的靈敏度和分析的通量，同時也提高抗體的識別和檢測。

高速的多重分析

    TTP LabTech的mirrorball非常適合這種“mix-and-read”實驗的分析，由于其靈敏度很高，從而可以檢測低豐度表達(dá)的細(xì)胞膜蛋白。該儀器不僅能夠快速進(jìn)行單激光掃描，而且可以同時進(jìn)行405,488,640nm激光掃描，因此可以進(jìn)行多種熒光素的選擇。其可以不依賴于激發(fā)光直接對發(fā)射熒光進(jìn)行矯正的能力，從而在抗體篩選應(yīng)用中可以對珠子和細(xì)胞進(jìn)行多重分析。

    該文章中以人EGFR抗體與細(xì)胞表面EGFR抗原結(jié)合為例，描述TTP Labtech的mirrorball儀器作為一種“mix-and-read”方法在在抗體篩選中的應(yīng)用。EGFR配體的蛋白家族參與了細(xì)胞遷移，粘附和分化等活動，包括乳腺癌，肺癌，結(jié)腸癌在內(nèi)的許多疾病都和EGFR的過度表達(dá)有著密切的關(guān)系，因此抑制EGFR的表達(dá)和激活在治療這些疾病過程中起著非常重要的作用。

    為了檢測mirrorball的檢測敏感性，該通訊利用兩種高表達(dá)EGFR的上皮癌細(xì)胞系A(chǔ)549和A431進(jìn)行檢測不同濃度的抗EGFR受體與EGFR的結(jié)合能力的分析。傳統(tǒng)篩選方法是采用表達(dá)和不表達(dá)抗原的細(xì)胞分別進(jìn)行抗體的結(jié)合能力以達(dá)到篩選抗原特異性的抗體，譬如利用轉(zhuǎn)染目的基因的細(xì)胞和未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞進(jìn)行反篩選。如果利用已有的篩選平臺（例如： ELISA和FMAT），需要進(jìn)行制備兩種板以比較抗體對這兩種細(xì)胞的結(jié)合能力，從而確定抗原特異性的結(jié)合能力。

    在該實驗中，mirrorball可以在一個細(xì)胞微孔板中對多種細(xì)胞進(jìn)行抗體結(jié)合能力的測定，以區(qū)分抗體對不同細(xì)胞的特異性結(jié)合。mirrorball的這種多元化分析能力在大大降低實驗的成本的同時，可以提高篩選的通量，排除微孔板之間的差異。

實驗方法

細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)

    該文章對表達(dá)EGFR受體的的A549和A431兩種細(xì)胞進(jìn)行了比較，A549，A431和Jurkat細(xì)胞購自Sigma。三種細(xì)胞的培養(yǎng)條件如下，A549細(xì)胞：含有10%FBS的DMEM，2mM L-glutamine和100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素；A431細(xì)胞：含有10%FBS的EBSS（Sigma），2mM glutamine，1×Non-essential Amino Acids(NEAA)(Sigma), 100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素；Jurkat細(xì)胞：RMPI-1640（Sigma），10%FBS，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素。A431和A549細(xì)胞培養(yǎng)到80%的密度時，利用0.25%胰酶和EDTA進(jìn)行消化，洗滌，重懸到新的培養(yǎng)基中。未有標(biāo)注的培養(yǎng)試劑均來自于Life Technologies。

抗體和試劑

    鼠抗人EGFR抗體購自Merck Chemical公司（#GR01）。山羊抗鼠IgG，AlexaFluor 647檢測標(biāo)志物（#A21235）來自于Life Technolgy。

CSFE和BiO標(biāo)記

    將5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester CFSE（sigma）溶解到DMSO中，使得CSFE濃度為100mM。將10nM CSFE加入細(xì)胞中，在室溫條件下孵育10分鐘，接著加入4%PBS（2ml）終止孵育，在37℃孵育10分鐘。將細(xì)胞進(jìn)行洗滌，在1000×g轉(zhuǎn)速下離心5分鐘。對于細(xì)胞計數(shù)分析，30nM的DiO（Life Technology）加入分析的混合物中，進(jìn)行孵育過夜。將細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記后，在488nm的激光下激發(fā)，在FL-1通道中檢測細(xì)胞的熒光信號。

EGFR實驗設(shè)計   

    將抗EGFR抗體在細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行梯度稀釋，將稀釋后的不同濃度抗體20ul加入384孔微孔板中（Costar 3712）。制備含有1.25×105 細(xì)胞/毫升的懸浮細(xì)胞（A431或者A549）和6nM 抗鼠IgG AlexaFluor 647標(biāo)記物的混合物。將20ul細(xì)胞混懸液分別加入含有抗體的微孔板中，然后將微孔板在37℃孵育過夜。在mirrorball對微孔板進(jìn)行檢測從而確定結(jié)合到細(xì)胞上的抗EGFR的量。

細(xì)胞多重分析實驗   

    將20ul稀釋后的不同濃度的抗EGFR抗體加入384微孔板中。制備含有相同細(xì)胞數(shù)的EGFR+A549和CSFE標(biāo)記的EGFR- Jurkat細(xì)胞混懸液（總細(xì)胞1.25×105 細(xì)胞/毫升，6nM 抗鼠IgG AlexaFluor 647標(biāo)記物）。該實驗是將20ul的細(xì)胞混懸液加入含有20ul的抗EGFR抗體的微孔板中（反應(yīng)孔中的細(xì)胞數(shù)為2.5×103 細(xì)胞和3nM檢測標(biāo)記物）。將微孔板在37℃中孵育過夜后， 放入mirrorball中利用488nm和640nm激光同時掃描檢測CSFE染料和結(jié)合的抗體的熒光強度。

mirrorball數(shù)據(jù)收集和掃描

   樣品利用mirrorball上的488nm和640nm的激光進(jìn)行掃描。每個孔的物體可以利用TTP Labtech專利的閾值運算進(jìn)行在位分析，同時可以提供形態(tài)和熒光參數(shù)。數(shù)據(jù)可以mirrorball特有的Cellista 軟件通過多種方式進(jìn)行顯示，包括柱狀圖，散點圖，3D熒光強度分布圖，整個孔的圖片。

結(jié)果

EGFR的Mix-and-read 分析的檢測靈敏度

    在該研究中，為了在細(xì)胞水平結(jié)合實驗中評估檢測的靈敏度，A431和A549細(xì)胞，不同濃度的EGFR抗體和Alexa Fluor 647標(biāo)記的山羊抗鼠IgG共同孵育過夜。圖1表明在A431細(xì)胞上EGFR抗體的檢測濃度為5ng/ml，而在A549細(xì)胞上其檢測限為5-10ng/ml。這表明EGFR在A549細(xì)胞上的表達(dá)水平比A431細(xì)胞表達(dá)水平低。   

    該結(jié)果表明利用mirrorball檢測抗EGFR抗體的水平和已經(jīng)退出市場的FMAT的檢測結(jié)果是一致的。兩種檢測方法在抗體濃度高于100ng/ml 時均出現(xiàn)總熒光強度降低的現(xiàn)象，該現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于文獻(xiàn)所說的“鉤子效應(yīng)”。由于一抗的過量存在，從而使得結(jié)合在檢測抗體的熒光無法讀取。

圖1. A431/A549上的總熒光強度隨抗EGFR抗體濃度增加而加強。

多激光掃描

    mirrorball的三激光使得用戶可以利用多種熒光標(biāo)記的標(biāo)志物進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)分析。在該研究中，A549細(xì)胞被DiO標(biāo)記（488nm激光激發(fā)），同時利用EGFR抗體和AlexaFluor 647標(biāo)記物進(jìn)行多重分析。經(jīng)過過夜的孵育，利用488nm和640nm雙重激光進(jìn)行細(xì)胞數(shù)和EGFR標(biāo)記分析。圖2表明在細(xì)胞數(shù)目恒定的情況下，，細(xì)胞的總熒光強度隨著EGFR抗體濃度的增加而加強。非常重要的一個特征，細(xì)胞數(shù)目可以在沒有EGFR抗體結(jié)合的情況下得到。

圖2：A549細(xì)胞總熒光強度隨著EGFR濃度增加而加強，細(xì)胞計數(shù)可單獨讀取。

細(xì)胞的多重分析

    mirrorball所獨有的多種激光同時掃描特征可以在轉(zhuǎn)染和宿主混合細(xì)胞中區(qū)分出抗原表達(dá)和未表達(dá)的細(xì)胞群體。為了闡明該方面的特性，在A549（EGFR+）和CSFE標(biāo)記的Jurkat （EGFR-）進(jìn)行EGFR抗體的結(jié)合篩選實驗。在分析之前，將Jurkat細(xì)胞進(jìn)行CSFE（10nM）的染色。圖3顯示了A549和Jurkat細(xì)胞在100ng/ml抗體的結(jié)合條件下的3D熒光強度圖譜，可以看到EGFR抗體特異性結(jié)合到A549細(xì)胞，在Jurkat細(xì)胞未檢測EGFR抗體的結(jié)合。

圖3： 細(xì)胞計數(shù)的三維分析。在混合細(xì)胞中，mirrorball利用多重激光掃描，可以同時檢測A549和Jurkat細(xì)胞的熒光信號。

    圖4顯示利用A549單一細(xì)胞和A549，Jurkat混合細(xì)胞進(jìn)行EGFR抗體結(jié)合實驗，其檢測靈敏度的沒有明顯的差異。

圖4：利用單一A549細(xì)胞和Jurkat，A549細(xì)胞進(jìn)行EGFR結(jié)合實驗的比較。利用單一細(xì)胞群體和混合細(xì)胞對結(jié)合實驗沒有明顯的差異。

討論

    TTP Labtech公司的mirrorball微孔板計數(shù)儀為細(xì)胞表面抗原抗體的篩選試驗提供一種穩(wěn)健，即混即讀的方法。該儀器非常適合抗體的研發(fā)，其獨有的光學(xué)元件和軟件設(shè)計使得該儀器具有極高檢測靈敏度，足夠檢測低豐度的蛋白的結(jié)合實驗。

    該文章表明EGFR實驗設(shè)計非常簡單，經(jīng)過簡單的修改即可在mirrorball上進(jìn)行分析。這種“Mix-and-read”分析方法與傳統(tǒng)的ELISA步驟比較可以免去洗滌，孵育步驟，從而大大節(jié)省篩選所需要的時間。 同時，該實驗采用較少的樣品和試劑消耗使得實驗的花費大大節(jié)省。

    mirrorball是提供多激光同時掃描的第一代分析系統(tǒng)，可以對熒光進(jìn)行激光之間的矯正。與合適的熒光試劑結(jié)合使用，這種多激光的同時掃描的能力可以進(jìn)行獨立的細(xì)胞識別和多參數(shù)分析，提供篩選的通量，大大降低實驗的成本，使得實驗操作非常的便利。在該文章中，采用DiO的反染，細(xì)胞數(shù)目可以不依賴于抗體的結(jié)合而直接進(jìn)行測定，這樣可以排除由于細(xì)胞接種的不同或者細(xì)胞毒性引起的假陽性。

    另外，mirrorball擁有在同一個孔中能夠區(qū)分出宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)染了特定基因細(xì)胞的能力，該能力可以極大的加速抗體篩選的進(jìn)程。mirrorball還擁有在同一孔對A431和Jurkat細(xì)胞進(jìn)行同時檢測的能力。 細(xì)胞的多重分析擁有很多優(yōu)勢，譬如可以排除不同細(xì)胞之間的板間差異，篩選通量增加一倍，減少樣品的使用量。

參考文獻(xiàn)
1. Lee, R., Tran, M., Nocerini, M. and Liang, M. (2008) A High-Throughput Hybridoma Selcetion Methods Using Fluorometric Microvolume Assay technology. J. Biomol. Screening 13: pp210-17.
2. Bowen, W. and Wiley, P. (2006) Application of Laser-Scanning Fluorescence Microplate Cytometry in High Content Screening. Assay and Drug Development Technologies. 4: pp209-2

如需更多信息，請瀏覽mirrorball產(chǎn)品信息。