腫瘤在不同氧氣量的代謝相互作用

Conn Carey¹ , Michelle Potter² , Luned Badder², Karl Morten²,, James Hynes¹
1 Luxcel Biosciences Ltd, Cork, Ireland
2 Nuffield Department of Obstetrics & Gynaecology, Uni. Oxford, Oxford, United Kingdom

要詳細了解腫瘤生物學, 關鍵是知道氧氣量和代謝之間的相互作用關系。 盡管有充足可用的氧，腫瘤偏向缺氧代謝會導致糖酵解增加，也會引起轉(zhuǎn)錄反應改變和遺傳不穩(wěn)定性，這種現(xiàn)象被稱為Warburg效應。但是，由于缺乏有效的體外工具能夠測量這些參數(shù)，科研人員對氧氣量和關鍵的代謝指標改變所知非常有限。

越來越多科研人員發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有的細胞培養(yǎng)條件是在高氧狀態(tài) （hyperoxic state）下進行的。現(xiàn)在更多科學家希望采用跟生理狀態(tài)更接近的氧濃度進行培養(yǎng)。 然而，控制環(huán)境氧濃度相對容易，但關鍵信息是細胞/組織的臨界氧濃度 (tissue oxygenation) 。在這里，我們向您推薦一種新型的熒光板閱讀器 (BMG Labtech Omega /ACU細胞專用讀板機) 配合Luxcel 公司新開發(fā)的試劑盒，可以并行監(jiān)測細胞內(nèi)的氧氣濃度（MitoXpress-Intra）和糖酵酵解通量glycolytic Flux（pH-Xtra™）。

這種測量可以詳細了解細胞真實的含氧量及其所帶來的糖酵解活動水平。 實驗使用BMG Labtech Omega /ACU細胞專用讀板機配備大氣控制單元（ACU）進行模擬腫瘤脫氧環(huán)境，數(shù)據(jù)揭示細胞單層和所在的環(huán)境氧氣濃度有著顯著差異，該差異在一般體外分析中是不太會注意到的。

測量原理是基于細胞內(nèi)吞MitoXpress Intra®氧氣探針，胞內(nèi)氧氣能淬滅探針所發(fā)出的熒光信號。隨著細胞的呼吸作用，細胞內(nèi)的氧濃度降低甚至耗盡， MitroXpress Intra®探針所發(fā)出的熒光信號，被淬滅的越來越少，熒光信號則相對越來越強。 通過比例測量時間分辨熒光強度（Fig 1）。實現(xiàn)實時測量細胞內(nèi)的分子氧瞬時變化，該系統(tǒng)也能對多個樣品的代謝活性瞬態(tài)變化進行快捷的分析，跟傳統(tǒng)細胞外檢測方法比較，能提供更全面的缺氧研究參數(shù)。

此外，通過Luxcel pH-Xtra 探針測量（在平行井，或同一井）胞外酸化率 (ECA) ,可同時監(jiān)控細胞糖酵解通量 （glycolytic flux），評估細胞的能量潛力（Energy Budget）。數(shù)據(jù)顯示代謝中的細胞單層（或3維細胞團）的氧濃度跟實驗施加的氧氣濃度，有著顯著差別；特別是在生理相關的氧濃度，其影響更大，從而影響細胞的氧化磷酸化和糖酵解ATP通路平衡。

通過測量細胞單層內(nèi)的氧化率，可以評估一些細微短暫的代謝活動變化，這是一般標準的胞外氧耗率測量做不到的。胞內(nèi)氧化率也允許評估特定激動劑對代謝的詳細影響。樣本數(shù)據(jù)列于Fig2。

Fig 2.

Fig 2. 抗霉素 (Antimycin) 及FCCP對HEK293T細胞單層的氧化水平的影響。抗霉素是一個ETC抑制劑，而FCCP則是ATP合成抑制劑。探針信號開始時反映了穩(wěn)定態(tài)的氧水平，由于細胞消耗氧，所以這水平較環(huán)境氧水平低�？姑顾匾种蒲鯕庀�耗，導致氧彌散到單層并把濃度升回到周邊空氣中的含量。 FCCP導致增加氧氣消耗，所以細胞單層中的氧濃度迅速下降直到新的穩(wěn)定狀態(tài)。

Fig 3.

Fig 3.降低未經(jīng)處理（呼吸）和抗霉素處理（非呼吸）細胞周邊氧濃度并監(jiān)測單層氧的變化。通過Fig3 BMG Labtech Omega/ACU讀板機把氧濃度步退到21％至5％之間。MitoXpress® Intra 信號反映了細胞層實際的氧濃度。注：細胞呼吸驅(qū)使細胞單層的氧濃度比ACU設計的濃度更低，在低氧環(huán)境下其影響為更明顯。

Fig4.

Fig4. pH-XTRA：pH反應(A)，原始數(shù)據(jù)輸出(B)，測量糖酵解抑制(C)
A）光學特性：經(jīng)同質(zhì)修正后pH探針的發(fā)射光譜在pH =7.5，7，6.5 及6。注意在pH值為7.5及6間信號增加7.5倍
B）原始數(shù)據(jù)輸出：Fig3列出梯度稀釋HepG2細胞濃度。增加細胞數(shù)量造成酸化率增加。％CV值 <5％顯示實驗數(shù)據(jù)的高重復性。
C）測量糖酵解抑制：加入2DG后因競爭性抑制減少葡萄糖攝取。 處理后的細胞表現(xiàn)出戲劇性及即時性和對劑量依賴的胞外酸化率下降現(xiàn)象。

Fig 5. HepG2細胞經(jīng)抗霉素A (Antimycin A) 和草氨酸 (Oxamate) 處理后之pH-XTRA動力學熒光信號(A) 和氫離子濃度(B)。Fig5C列出經(jīng)處理及沒處理之細胞有著明顯的酸化率差異。而Fig5D顯示低氧氣濃度對胞外酸化率的影響。

一）測量糖酵解抑制作用：經(jīng)草氨酸處理后乳酸脫氫酶 (LDH) 受到抑制，減少酸化�？姑顾靥幚砗蠹毎�增加糖酵解流量以維持ATP量，所以增加酸化率。
二）低氧增加Warburg 反應：氧濃度從21％降低至6％，導致酸化率增加。

Fig 6. 測量HepG2 3D RAFT (TAP Biosystems)細胞結(jié)構(gòu)之胞內(nèi)氧氣量： 通過BMG Labtech Omega/ACU 細胞專用讀板機 調(diào)節(jié)周邊氧氣量在21 ％和1％之間 (A)，及跨越各種氧濃度下線粒體經(jīng)調(diào)節(jié)劑處理之反應(B)。
（1）細胞供氧低于溶液中的氧：使用MitoXpress® Intra 測量細胞的氧含量，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)氧氣水平跟周邊水平（ACU水平）有著顯著分別 （A）。
（2）缺氧環(huán)境：溶液中的氧氣仍是約 3 ％，但細胞已出現(xiàn)缺氧呼吸（A） 。
（3） 測定線粒體毒性：抗霉素，魚藤酮 (Rontenone) 和FCCP處理后改變細胞的氧濃度，反映線粒體毒性。
注： MitoXpress®Intra 探針是在不同處理劑添加前16小時前添加的。該探針非常穩(wěn)定并可逆，可以在特定氧氣條件下進行實時監(jiān)控（多個）藥物對細胞的影響。

Fig 7. 在周邊氧濃度為21％下使用MitoXpress®- Intra測量經(jīng)藥物處理后之HepG2 3D RAFT細胞團氧含量之改變。
（1）藥品添加：加入線粒體解偶聯(lián)劑FCCP，引起3D RAFT細胞團出現(xiàn)短暫但顯著的深化缺氧。

注： MitoXpress®Intra 探針非常穩(wěn)定并可逆，可以在特定氧氣控制條件下進行實時監(jiān)控（多個）藥物對細胞的影響。不需要額外的化學程序。

通過使用胞內(nèi)氧（MitoXpress-Intra）和糖酵解通量（pH Xtra）試劑盒及BMG Omega/ACU 細胞專用讀板機 （在平行井或同一井）允許方便地測量細胞能量潛力 (Energy Budget)，從而可對細胞系進行代謝圖譜探究。

雖然測量2D細胞單層培養(yǎng)也能得到非常多資料，但通過胞內(nèi)氧（MitoXpress-Intra）和糖酵解通量（pH Xtra）試劑盒及BMG Omega/ACU 細胞專用讀板機可以方便地測量3D 細胞團的能量潛力，并提供了更多的更接近生理狀態(tài)下的細胞相關數(shù)據(jù)。例如利用球細胞團 （Spheroid）研究腫瘤生物學。Fig8顯示出從三個細胞系產(chǎn)生的球細胞團的氧濃度。球細胞團內(nèi)的缺氧深度可能相當大，缺氧程度跟細胞團大小和代謝狀態(tài)相關。MitoXpress®Intra細胞穿透性染料允許測量整個球細胞團的氧濃度*。

Fig 8.

Fig 8. 氧化細胞系產(chǎn)生的球細胞團的胞內(nèi)氧氣量

代謝圖譜 ： 3個細胞系有著不同的胞內(nèi)氧氣量/呼吸需要。 RD 及New U87MG 均比環(huán)境氧氣量低。

MitoXpress® - Intra和pH- Xtra為測量細胞單層的氧氣量及細胞能量潛力提供了一個易于使用的解決方案。
兩個探針都是穩(wěn)定并可逆的，不需要額外的化學程序（不需礦物油層覆蓋細胞）。
MitoXpress® - Intra和pH- Xtra可以在平行井或同一井內(nèi)進行使用，使用高端分辨熒光讀板機（BMG LABTECH FLUOstar Omega/ ACU）可進行準確測量。
這研究顯示在環(huán)境，培養(yǎng)液，及細胞層的氧氣量有著顯注的差異，- 所以顯出了測量細胞層內(nèi)氧氣濃度的重要性。 其效果在3D RAFT 細胞團及球細胞團中更顯著。
改變 “可用氧氣量” 可以顯著引起細胞代謝變化，其中包括糖酵解流量顯著增加。
MitoXpress® - Intra和pH- Xtra可提供高通量解決方案去衡量藥物在已知及控制的氧氣水平下對細胞代謝的影響。

材料與方法 ： 請參照原文

http://luxcel.com/wp-content/uploads/2013/05/Monitoring-the-interplay-between-oxygen-availability-and-metabolism-in-tumour-biology.pdf