使用酶標(biāo)儀的細(xì)胞成像系統(tǒng)檢測標(biāo)簽蛋白的表達(dá)-Molecular Devices SpectraMax I3

優(yōu)勢：

1.   帶細(xì)胞成像系統(tǒng)的功能模塊擴展了微孔讀板機的檢測應(yīng)用
2.   方便檢測每個細(xì)胞或每孔的標(biāo)簽蛋白的表達(dá)水平
3.   按照一般微孔讀板機的簡單流程
4.   細(xì)胞可視化數(shù)據(jù)輸出，增加了數(shù)據(jù)可信性

某些細(xì)胞蛋白存在或不存在，可代表著細(xì)胞對某些刺激的反應(yīng)、某種分化的狀態(tài)或特定細(xì)胞類型的獨特特征或者基因的成功轉(zhuǎn)染。如血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)一般不存在于正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞，但在細(xì)胞因子TNF-α的體外刺激引起的炎癥反應(yīng)，會出現(xiàn)VCAM-1的表達(dá)。這種細(xì)胞中某種特殊標(biāo)志蛋白的表達(dá)，可以很容易地使用微孔板成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測和定量。

定量測量細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)在96孔板中培養(yǎng)48小時，接著使用抗炎化合物SB202和SB203的不同劑量刺激2小時；然后使用TNF-刺激24小時，細(xì)胞表達(dá)VCAM-1；然后用4％的多聚甲醛固定細(xì)胞，接著使用抗VCAM熒光素標(biāo)記的抗體染色。使用S p e c t r a M a x M i n iMax細(xì)胞成像系統(tǒng)(SpectraMax i3多功能讀板機的用戶可升級模塊)進(jìn)行細(xì)胞成像，影像分析使用Soft-Max Pro軟件內(nèi)的蛋白表達(dá)Protocol實時進(jìn)行。使用SoftMax Pro的濃度效應(yīng)曲線擬合，進(jìn)行化合物的藥效的評價，結(jié)果顯示化合物成功地抑制了細(xì)胞因子的刺激，從而抑制了后續(xù)的VCAM-1的表達(dá)。

VCAM-1的表達(dá)水平的定量，通過設(shè)置熒光強度閾值過濾掉背景熒光和大小閾值過濾掉微小的雜質(zhì)，如劃痕，顆�；驓馀荨�圖1表示在SoftMax Pro中如何進(jìn)行蛋白標(biāo)志物的分析設(shè)置程序。

熒光素標(biāo)記的VCAM抗體染色的固定細(xì)胞，使用標(biāo)簽蛋白表達(dá)程序進(jìn)行鑒定，由于細(xì)胞幾乎連成一片，所以此程序設(shè)置為檢測整個視野內(nèi)蛋白總體表達(dá)，而非是進(jìn)行單個細(xì)胞計數(shù)。

圖1 陽性和陰性樣品讀板前的測試分析參數(shù)設(shè)置

圖1， SoftMax Pro軟件界面擁有幾個可視化的組件，以幫助建立圖像分割最佳參數(shù)設(shè)置。
1：調(diào)整背景強度和對象大小閾值來識別熒光細(xì)胞。
2：在陽性和陰性孔內(nèi)，可視化生成的分割遮罩，以幫助判斷是否需要進(jìn)一步的參數(shù)調(diào)整。
3：選擇能展示陽性孔和陰性孔直接較大差異的輸出參數(shù)，如直方圖的顯示方式。
標(biāo)記的表達(dá)程序是用來識別熒光素標(biāo)記的抗VCAM抗體標(biāo)記的區(qū)域。 VCAM-1的存在表示
炎癥應(yīng)答的陽性反應(yīng)。

圖2 細(xì)胞對抗炎化合物的反應(yīng)應(yīng)答

左側(cè)的圖像顯示熒光VCAM-1表達(dá)的細(xì)胞，右圖加上紫色遮罩，顯示軟件對表達(dá)炎癥標(biāo)簽蛋白的劃分；高劑量的抗炎化合物SB202處理的細(xì)胞(上排)顯示出很少的VCAM-1的表達(dá)，而低劑量的抗炎化合物SB202處理的細(xì)胞(下排)使用細(xì)胞因子后，則表達(dá)出大量的VCAM-1。所有的值為經(jīng)過歸一化處理后的總強度值。

標(biāo)記表達(dá)分析實驗的更多信息

SpectraMax MiniMax細(xì)胞成像系統(tǒng)可提供簡單酶標(biāo)熒光強度檢測值所不能提供的可視化數(shù)據(jù)和信息。熒光檢測區(qū)域可定位到表達(dá)感興趣的標(biāo)簽的細(xì)胞，大的成像視野允許將數(shù)量龐大的細(xì)胞一次整合。友好的SoftMax Pro軟件分析界面，允許進(jìn)行濃度效應(yīng)曲線擬合和計算IC50值等�？傊�，MiniMax細(xì)胞成像系統(tǒng)簡化了細(xì)胞成像過程，提供了和補充了在細(xì)胞標(biāo)簽蛋白表達(dá)檢測方面標(biāo)準(zhǔn)酶標(biāo)儀檢測所不能提供的重要信息。