二手煙對細胞暴露及其對呼吸道病毒感染的易感性研究

二手煙對細胞暴露及其對呼吸道病毒感染的易感性研究目標是了解二手煙的暴露對病毒性呼吸道疾病的形成有何促進作用。本研究項目的目的是確定在病毒感染中二手煙霧暴露的影響，在肺上皮細胞模型，使用兩種流行的人類呼吸道病毒：鼻病毒和腺病毒。

腺病毒（AD）是無包膜DNA病毒，是兒科需要住院治療的呼吸系統(tǒng)疾病的重要病原體。這些病毒也是造成急性呼吸道傳染性疾病爆發(fā)的主要原因。B類（如血清3型，7型和11型），C類（如血清5型），和E類（例如血清4型）是最常見的呼吸道病原體。

人鼻病毒（HRV）是小核糖核酸病毒家族的成員。這些高度多樣化的無包膜RNA病毒是重要的人類病原體和普通感冒的最常見的病原體。流行病學研究表明，HRV感染可能與哮喘和COPD病情加重有關。

我們推測，通過二手煙的暴露，增加受體分子的有效性和促進細胞進入，從而增加呼吸道病毒的感染。該研究的理論基礎是，確定二手煙暴露增加呼吸道感染易感性的機制， 進而進一步干預以減少呼吸道疾病。這一假設將通過三個明確的目標進行驗證：

目標 1.

確定二手煙暴露對呼吸道上皮細胞的滲透性及病毒受體的數(shù)量和有效性的影響。

 

目標 2.

確定二手煙暴露在體外對呼吸道病毒感染的氣道上皮細胞的影響。

 

目標 3.

確定二手煙暴露對病毒感染促炎反應的影響。

 

香煙相對濕度保持30%~40%。實驗中，細胞暴露于香煙煙霧8分鐘/次。主流香煙煙霧的每次吸煙量保持30.10ml。側流香煙煙霧保持在78.36ml。采用Cultex細胞暴露系統(tǒng)（Hannover,Germany），細胞體外的氣-液（ALI）培養(yǎng)，并在氣-液界面進行香煙煙霧的高效暴露。

 

  

在transwell上極化Calu3細胞，主流煙和測流煙暴露10～30分鐘后，結果TER(跨上皮電阻)值降低。主流煙暴露的細胞，TER值可以恢復；測流煙暴露的細胞，在實驗1～24小時內TER值沒有恢復，表明暴露損傷為不可逆損傷。

 

可以觀察到，在MOI 1 PFU／cell的3個獨立感染實驗3天后，總的傳染性病毒產(chǎn)量沒有大的變化。然而，在煙霧暴露和感染Ad3p細胞中，傳染病毒產(chǎn)量有明顯的增加趨勢。

當對頂層、細胞內以及底部的感染病毒產(chǎn)量進行評估時，發(fā)現(xiàn)在底部沒有檢測到病毒。有趣的是，在主流煙和測流煙感染Ad4和Ad5后的頂層和細胞內病毒滴度有明顯的增加。在MOI  1.0 PFU/cell感染三天后的感染病毒的產(chǎn)量評估。

 

 

在MOT為10.0 PFU/cell,感染了非復制型Ad5-CMV-mCherry的Calu3細胞的mCherry熒光蛋白的表達量的熒光顯微鏡的檢查。過濾測流煙空氣的暴露實驗作為對比控制，10X倍數(shù)觀測。初步數(shù)據(jù)顯示，側流煙霧暴露導致進入的感染病毒量增加。重復實驗并通過流式細胞術對細胞表達的mCherry的數(shù)量進行定量評估。

  

 

   在1.0 PFU/cell MOI感染Ad3p，Ad4p和Ad5p6小時和18小時后，暴露于主流煙和測流煙，采用懸浮芯片檢測腺病毒感染Calu3細胞促炎細胞因子反應。

 

總的來說，目前的實驗結果表明，如腺病毒，暴露于主流或側流煙霧沒有顯著提高受感染細胞的鼻病毒的復制。在MOI為0.1，0.5，1.0和5.0 PFU/cell的數(shù)據(jù)集之間沒有觀察到顯著可測量的差異。令人鼓舞的發(fā)現(xiàn)是，可以在transwell系統(tǒng)的頂部，細胞和基底室單獨感染腺病毒的產(chǎn)量評估，并進行類似的鼻病毒實驗，以提高我們的檢測差異的能力。

 

目前數(shù)據(jù)的初步分析表明，極化肺上皮細胞的香煙煙霧暴露（無論是主流煙和側流）導致可測量的增強腺病毒的復制。此外，這些細胞暴露于吸煙前，腺病毒感染加劇了他們在感染后18小時以上炎癥反應，可能是由于增加了病毒進入的結果。

 

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