無標記活細胞動態(tài)分析技術在神經(jīng)生物學方面的應用

 

神經(jīng)生物學是生物學中研究神經(jīng)系統(tǒng)的解剖、生理和病理方面內(nèi)容的一個分支。神經(jīng)科學尋求解釋神智活動的生物學機制，即細胞生物學和分子生物學機制。近年來神經(jīng)干細胞逐漸成為神經(jīng)生物學中的一大研究熱點。神經(jīng)干細胞是一群能自我修復和具有多種分化潛能的細胞，通過體外分離純化得到的小鼠或人源神經(jīng)干細胞，可以在特定條件下分化成為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)和少突膠質(zhì)等細胞，從而成為再生醫(yī)學中極為理想的理論研究對象和臨床應用來源。神經(jīng)干細胞的這種特性為神經(jīng)損傷和中樞神經(jīng)退行性疾病的治療提供了可能的途徑，并為損傷或病變的中樞神經(jīng)組織恢復相應的功能這些人類多年來一直未能解決的治療難題提供了廣闊的思路和誘人的前景。

 

目前對神經(jīng)干細胞在增殖、分化和凋亡過程中的機制研究，主要通過顯微鏡成像、芯片表達譜、免疫組化和電生理學這些傳統(tǒng)的“終點檢測法”來完成數(shù)據(jù)的獲取和分析，這種實驗方法僅能在預先設定的有限時間點上采集數(shù)據(jù)，這樣由于無法觀察到整個實驗進程的變化，研究者很容易忽視一些重要的生物學事件。因此，如果采用活細胞動態(tài)觀察來完整地記錄實驗進程，不但避免了一些有意義的生物學事件的丟失，而且能了解到此事件是如何形成的（例如單個神經(jīng)干細胞從開始分裂、增殖并隨后分化直至最后凋亡的全過程），這種動態(tài)的完整記錄對于科研工作者而言是非常直觀和具有啟發(fā)意義的。

 

此外，傳統(tǒng)的“終點檢測法”往往需要把細胞進行各種生物素標記或熒光染色，而這些標記可能對細胞的生物學活動有潛在的影響，因此檢測的指標并不能真正反映細胞生理上的變化。如果有一種真正的無標記檢測手段，使細胞在沒有任何外界干預而自然生長的情況下，對各種細胞形態(tài)變化的參數(shù)進行分析，就能達到還原最真實的細胞行為變化的目的。CM Technologies公司的Cell-IQ無標記活細胞分析平臺則為我們提供了這樣一種新的可能。

 

●  神經(jīng)干細胞的分化

●  神經(jīng)元突觸的測量

●  神經(jīng)干細胞（或神經(jīng)球）的增殖

●  神經(jīng)元/神經(jīng)元的遷移和運動能力的追蹤

●  神經(jīng)干細胞發(fā)育的譜系分析

 

 

Cell-IQ對于無標記細胞相差圖像的分析原理就是基于其對細胞形態(tài)的識別。下圖是一張神經(jīng)干細胞經(jīng)過三天分化后的相差圖。這張圖片中的所有細胞從形態(tài)上大概可以分為以下四種類型：圖A的類神經(jīng)膠質(zhì)細胞；圖B的類神經(jīng)元細胞；圖C的正處于增殖分裂的細胞；圖D的一些細胞碎片。Cell-IQ的軟件能對其中每種類型的典型細胞進行識別、挑選和分門別類，并根據(jù)這樣一個分類細胞庫，自動統(tǒng)計各類細胞的個數(shù)和比例，以生成一條隨時間變化的動態(tài)曲線，以此研究在這段時間中，神經(jīng)干細胞的分化情況。

 

 

 

 

Cell-IQ可以對所分化的神經(jīng)元突觸長度和細胞個數(shù)進行測量和計數(shù)，并對不同的處理組結果進行比較。相比于傳統(tǒng)的需要將照片獲取后，然后進行手工或者半自動的測量實驗操作方式而言， Cell-IQ軟件可以進行批量化處理，極大地提高分析效率，花費更少的時間和人力，而結果更加真實可靠。

 

左圖是一個神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞（NG108-15）的分化實驗，實驗先用isoquercitrin（一種黃酮類化合物）處理NG108-15細胞后，再放入Cell-IQ中進行4天的分化誘導和圖像采集。圖中紅點代表的是神經(jīng)細胞，藍線為軟件所識別的分化后的神經(jīng)元突觸。實驗結果表明，在培養(yǎng)基-1的條件下，NG108-15細胞的分化更為顯著。

 

 

 

 

細胞追蹤是細胞學和生物學研究中重要的組成部分之一，在細胞行為、藥物和疾病中的研究至關重要，尤其對神經(jīng)干細胞增殖和分化的變化以及細胞相互作用的調(diào)控機制研究具有重要的意義。目前對一個目標細胞或大量細胞進行全面和準確地追蹤，同時盡量避免其他細胞的干擾，是細胞追蹤的難點，也是近些年細胞追蹤的研究熱點。Cell-IQ強大的分析軟件可以對每個細胞的活動軌跡進行自動或手動追蹤和標記，然后繪制出中心軌跡圖或者角度分析圖，并能給出每個細胞的移動距離、位移、速度和方向等參數(shù)。

 

下圖為一個小鼠胚胎腦皮層來源的神經(jīng)干細胞的運動追蹤分析實驗。采集到圖像后，Cell-IQ軟件可以對視野中的每個細胞或者所有細胞進行追蹤，并得到每個細胞最終的運動軌跡和方向圖，其余的如運動距離和速度等參數(shù)都能以Excel格式保存，方便隨時調(diào)用或用第三方軟件分析。

 

 

 

 

 

 

神經(jīng)干細胞可以通過對稱分裂的方式進行增殖，或通過不對稱的分裂方式產(chǎn)生神經(jīng)組織的其他各類細胞。其中，干細胞的譜系分析是研究神經(jīng)干細胞發(fā)育和分化機制的重要工具和手段。通過建立細胞譜系標記技術來追蹤神經(jīng)干神經(jīng)的分裂和分化，從而得到細胞的譜系圖，在神經(jīng)干細胞分化調(diào)控機制的研究中具有重要意義。

 

下圖為小鼠胚胎腦皮層來源的神經(jīng)干細胞的分裂譜系分析實驗。分析時，我們選取了視野中的三個細胞進行增殖和分裂的追蹤，并詳細記錄了一個細胞如何從單個細胞分裂成兩個再到四個，最后停止增殖分裂的全過程。最后，Cell-IQ軟件能根據(jù)追蹤的結果，自動得到每個細胞增殖分裂的譜系圖。

 

 

 

 

3D細胞培養(yǎng)旨在建立最貼近生理條件下的實驗系統(tǒng)，從而更好地模擬細胞在體內(nèi)的生長環(huán)境。然而3D細胞樣品如神經(jīng)球成像一直以來是一個難題，許多傳統(tǒng)的顯微鏡無法同時對多個平面進行聚焦從而保持整個球體細胞的圖像清晰。Cell-IQ的多層Z-stack掃描成像技術配合智能追焦功能，可以跟蹤細胞樣品在Z軸的高度變化而自動調(diào)整最佳的聚焦平面，從而確�；罴毎�在長時間的生長、運動過程中總處于聚焦范圍內(nèi)，因此可以對3D細胞樣品如神經(jīng)球和胚胎等進行成像和分析。

 

 

上圖為球體細胞（spheroid）的增殖實驗，在加入抑制劑后，球體細胞向外遷移和增殖的能力得到了顯著的抑制。Cell-IQ的軟件能夠分別對綠色的球體本體和紅色的遷移細胞進行面積的計算，從而實時動態(tài)地定量給藥前后球體細胞向外遷移增殖的情況。

 

 

上圖為懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)球增殖實驗。通過降低載物臺的移動速度和加速度，減少震動對體系的影響，懸浮細胞同樣能進行成像和分析。實驗結果表明，給藥處理后顯著抑制了神經(jīng)球的增殖。

 

除了在相差圖片上的無標記分析外，Cell-IQ還提供了3種熒光通道，多達30多種熒光濾片的選擇，可以滿足絕大多數(shù)熒光染色的需求。因此，一方面我們可以對已經(jīng)標記熒光的細胞同時進行相差圖片和熒光圖片的采集、合并和分析；或者在完成相差圖片的采集后，再將細胞固定后進行傳統(tǒng)的免疫熒光染色以進一步驗證無標記的分析結果。

 

下圖為神經(jīng)干細胞的分化實驗。圖A為相差圖片，圖B為神經(jīng)元marker βIII-tubulin的染色結果。在圖A和B中，紅色箭頭所指的神經(jīng)元突觸表明相差圖片和熒光染色的結果是相互匹配的。圖C的白色短箭頭代表的是類神經(jīng)元細胞，同樣在圖D的染色中得到了證實（紅色）；而圖C的白色長箭頭在形態(tài)上類似于膠質(zhì)細胞，而這個結果也與圖D膠質(zhì)細胞的 marker vimentin染色（綠色）結果相一致。

 

 

 

結束語：以上是無標記活細胞動態(tài)分析技術在神經(jīng)生物學方面的應用。其中不難看出，無標記分析技術的原理是基于在相差圖片的基礎上，通過對細胞形態(tài)的識別和分辨來對細胞行為變化的各種參數(shù)進行實時動態(tài)地定量分析。因此，無標記活細胞動態(tài)分析技術旨在杜絕一切外界因素（如生物素標記和熒光染色）干擾的情況下，盡可能地讓細胞自然地生長從而還原細胞最天然的生理狀態(tài)，通過在這種“原生態(tài)”的細胞上動態(tài)觀察和實時定量細胞形態(tài)、行為的變化，力求記錄一個最真實的生物學事情的發(fā)生和演變！

平臺簡介：Cell IQ是芬蘭CM Technologies公司生產(chǎn)的一個集培養(yǎng)管理、觀察記錄和分析于一身的一體式無標記活細胞動態(tài)分析系統(tǒng)。其通過專利細胞封蓋系統(tǒng)來實現(xiàn)精密的微小培養(yǎng)室體系，從而保證細胞在最優(yōu)的生長環(huán)境下維持一個健康穩(wěn)定的狀態(tài)以進行長期的培養(yǎng)觀察和記錄。內(nèi)置的成像系統(tǒng)和專業(yè)高靈敏的數(shù)碼CCD相機，再配合獨特的全聚焦和智能追焦技術，可確�；罴毎�在長時間的生長和運動過程中總處在聚焦范圍內(nèi)，以此獲得高質(zhì)量的細胞相差圖片，因此可以對3D細胞樣品如神經(jīng)球和胚胎等進行成像和分析。最后，Cell-IQ強大且創(chuàng)新的的分析軟件可在完全無標記的“原生態(tài)”細胞相差圖像上，通過對其形態(tài)的分辨與識別來進行不同細胞種群、周期和時期的區(qū)分劃類從而完成各種復雜的無標記實驗。