BioTNT mRNA 引物篩選，引物定制或specific primers的使用說(shuō)明書(shū)

版本號(hào)：20100001

目錄號(hào)：SER-PCR –編號(hào)（500T）;

說(shuō)明書(shū) Part A

 

本試劑盒是基于最可靠的SYBR® Green-based定量real-time PCR試劑盒并應(yīng)用基因表達(dá)分析。

我們的實(shí)驗(yàn)為基因特異性定量PCR驗(yàn)證具有統(tǒng)一、高效和標(biāo)準(zhǔn)化特點(diǎn)的擴(kuò)增反應(yīng)條件。

每一對(duì)引物都是經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的。

已經(jīng)使用適當(dāng)?shù)膔eal time PCR Mix的時(shí)候，合適的片段大小和高的擴(kuò)增效率成為保證。

qRT-PCR Primer pair kits統(tǒng)一的擴(kuò)增效率和條件為熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)中多基因表達(dá)的檢測(cè)提供了準(zhǔn)確而靈活的解決方案。

完整的試劑盒說(shuō)明書(shū)由part A 和Part B構(gòu)成。Part A 主要描述了本試劑盒的使用方法和注意事項(xiàng)，Part B主要注明了assay 的特異情況。

 

本產(chǎn)品適用于有一定q PCR實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)的客戶(hù)或者無(wú)經(jīng)驗(yàn)的客戶(hù)在公司的技術(shù)指導(dǎo)下進(jìn)行。

 

可在常溫下運(yùn)輸。常期保存請(qǐng)?jiān)?20℃保存，效期12個(gè)月。

 

請(qǐng)?jiān)谑盏酱嗽噭┖泻罅⒖虣z查試劑盒組成，BioTNT 公司只負(fù)責(zé)受理在試劑盒簽收后三個(gè)工作日內(nèi)的試劑缺失報(bào)告；

 

 

 

1、   耗材：0.5 mL或1.5mL Eppendorf管（無(wú)菌、無(wú)酶、RNase-free；貨號(hào)），Tips(RNase-free)（1000μL、200μL、10μL的槍頭；）；

2、   檢測(cè)的樣本CDNA；

3、   無(wú)菌無(wú)酶的 PCR 水（貨號(hào)：A2010B0X03）；

4、   離心機(jī)；移液器（10μL ，200μL，1000μL）；

5、   手套，口罩。

 

1、   經(jīng)常更換新手套，以防止RNase污染；

2、   使用無(wú)RNase的塑料制品和槍頭避免交叉污染；

3、   RNA在Rrizol試劑中時(shí)短時(shí)間內(nèi)不會(huì)被RNase降解，但提取后繼續(xù)處理過(guò)程中應(yīng)使用不含RNase的塑料或玻璃器皿（玻璃器皿可在150℃燒烤4小時(shí)，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分鐘，然后用DEPC水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase）；

4、   配制溶液應(yīng)使用RNase-free ddH₂O（貨號(hào)：A2010B0X03）

 

1、 請(qǐng)混勻所有的試劑（15秒）；

2、 請(qǐng)按以下配比對(duì)每個(gè)反應(yīng)配20μL的體系：

*注意：建議MIX引物、標(biāo)本與PCR水預(yù)混，在實(shí)驗(yàn)操作中盡量避免使用移液器的最小量程，盡量減少加樣次數(shù)，以減少因加樣而導(dǎo)致的誤差。在操作中，應(yīng)使用不含熒光物質(zhì)的一次性手套(經(jīng)常替換)、移液器頭(帶濾嘴自卸式)，不能用手直接觸摸PCR反應(yīng)管/條/板。

*注意：如果使用其他體積的體系（5-50μl），應(yīng)保證終濃度與說(shuō)明書(shū)上的終濃度一致。配制反應(yīng)體系時(shí)，應(yīng)注意移液器的使用方法，所有的液體都要緩慢加至管底，不要加至管壁，所有液體的混勻要用振蕩器進(jìn)行，不能用移液器吹打，避免產(chǎn)生氣泡。如果產(chǎn)生氣泡，請(qǐng)用手指將氣泡彈破，再低速離心。反應(yīng)體系配制完畢后低速離心數(shù)秒，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

*大多數(shù)儀器建議采用20ul體系；Roche的lightcycler 和ABI 7900，stepone plus，viia7 等可以采用10ul體系；

*建議每個(gè)樣本同一個(gè)基因做雙重復(fù)或者三重復(fù)；

*設(shè)立陰性對(duì)照(即加樣品的時(shí)候用水來(lái)代替);

*建議購(gòu)買(mǎi)BioTNT 的陽(yáng)性對(duì)照( 貨號(hào): A2010B0X10 ); 并在實(shí)驗(yàn)中設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照;

 

1、  低速離心數(shù)秒，并且按照熒光PCR儀的使用說(shuō)明放置好您的PCR管/條/板；

2、  從下列表中選擇最合適的實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件，按照熒光PCR儀的使用說(shuō)明設(shè)置好PCR反應(yīng)條件：

 

熒光PCR儀	循  環(huán)	時(shí)  間	溫  度
ABI: 5700, 7000, 7300, 7500, 7700, 7900HT, StepOnePlus BioRad: iCycler®, iQ5, MyIQ Stratagene: Mx3000p, Mx3005p, Mx4000p Eppendorf: Mastercycler® ep realplex	1	5 minutes  [1]	95℃
	40	15 seconds	95℃
		1 minute  [2]	60℃
Roche*: LightCycler 480®	1	5 minutes  [1]	95℃
	45	15 seconds	95℃
		1 minute  [2]	60℃

 

3、下列儀器使用三個(gè)步驟的循環(huán)程序：

 

[1]95℃ 5分鐘的步驟是為了激活熱啟動(dòng)DNA聚合酶。

[2]檢測(cè)并記錄熒光染料熒光信號(hào)在每個(gè)周期的延伸結(jié)束時(shí)。

[3]不同的儀器需要檢測(cè)熒光信號(hào)的時(shí)間長(zhǎng)短不同，請(qǐng)根據(jù)您的儀器選擇適當(dāng)?shù)难由鞎r(shí)間。

 

反應(yīng)條件示例：95℃ 5分鐘→95℃ 15秒→60℃ 30秒（讀板）→溶解曲線(xiàn)分析；

40個(gè)循環(huán)

 

注：以上反應(yīng)條件是應(yīng)用BioTNT 染料法premix（貨號(hào)：A2010A0112），在ABI stepone plus上的反應(yīng)條件。請(qǐng)注意，第一步95℃ 5分鐘 是BioTNT premix的hot start的特點(diǎn)，如使用其他公司的premix，請(qǐng)調(diào)整這一步的反應(yīng)時(shí)間。

 

  i.陽(yáng)性對(duì)照(或者客戶(hù)的陽(yáng)性模板)的內(nèi)參基因的熔解曲線(xiàn)呈單峰，其Tm與引物說(shuō)明書(shū)上的產(chǎn)物Tm相近；擴(kuò)增曲線(xiàn)呈S型； 雙重復(fù)重復(fù)良好（Ct值相差不超過(guò)1），說(shuō)明加樣誤差和儀器誤差比較小，可用；如果 CT相差超過(guò)1.5，該數(shù)據(jù)不可用，需要重新檢測(cè)；

  ii.陰性孔Ct＞33，熔解曲線(xiàn)在目的產(chǎn)物或內(nèi)參產(chǎn)物峰處無(wú)明顯特異性產(chǎn)物峰出現(xiàn)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)體系無(wú)污染，數(shù)據(jù)可信；

 iii.內(nèi)參實(shí)驗(yàn)的CT值在15-25之間，可根據(jù)文獻(xiàn)來(lái)確定內(nèi)參基因CT應(yīng)該在的區(qū)域，來(lái)進(jìn)行數(shù)據(jù)判斷，抽提和逆轉(zhuǎn)錄的可靠性；

iv.其他情況請(qǐng)參考實(shí)驗(yàn)疑難分析與解答或咨詢(xún)公司技術(shù)人員。

 

 

 

 

 

1、  Trizol法總RNA提取試劑盒，貨號(hào)： A2010B0A01（20T）， A2010B0A02（50T），A2010B0A03（100T）；

2、  cDNA第一鏈合成試劑盒，貨號(hào)：A2010B0B01（50T），A2010B0B02（100T）；

3、  real time PCR Premix試劑盒，貨號(hào)： A2010A0112；

4、  目的基因陽(yáng)性對(duì)照，貨號(hào)：A2010B0X10；

5、  內(nèi)參基因real time PCR primer pairs，貨號(hào)：A2010AH001  （500T）;  A2010AM001  （500T）;  A2010AR001 （500T）；

 

品質(zhì)保證：

所有產(chǎn)品由BioTNT 進(jìn)行品質(zhì)保證。