使用冷凍分裝技術(shù)提高糞便微生物菌群研究的效率和質(zhì)量：突破處理糞便樣本難題

作者：Graham S. Long, Joseph M. Fraone, and Larry Chin

 

 

目前，腸道微生物菌群研究已經(jīng)成為科學(xué)研究領(lǐng)域越來(lái)越重要的一個(gè)方向，腸道微生物菌群研究在藥物研發(fā)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究、疾病預(yù)防和診斷等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值，潛力巨大。然而，糞便樣本除了物流運(yùn)輸這一關(guān)鍵步驟以外，還面臨著健康和安全性的系列挑戰(zhàn)，同時(shí)直接接觸這些樣本往往也是不受歡迎的操作處理方式。

 

因?yàn)榧S便樣本一般呈半固體狀態(tài)，難以使用傳統(tǒng)的人工或者自動(dòng)化液體工作站進(jìn)行操作，由于高通量操作能力的限制，所以很難將小型實(shí)驗(yàn)性研究升級(jí)成大型項(xiàng)目型研究。

  

針對(duì)以上描述的各項(xiàng)困難與挑戰(zhàn)，  種新型、高效的冷凍樣本分裝技術(shù)為其提供了相應(yīng)的解決方案。通過(guò)將糞便樣本保持在冷凍狀態(tài)下（溫度控制在-80C或以更低水平），消除凍融循環(huán)，可以很好地保存微生物菌群的活體特征。此外，冷凍樣本分裝提供一種安全且一致性的樣本操作方法。由于抑制了令人不悅的氣味產(chǎn)生，幫助實(shí)驗(yàn)人員輕松的處理更多的糞便樣本，改善了實(shí)驗(yàn)環(huán)境。

 

目前市面上僅有兩款儀器可以用于實(shí)驗(yàn)室的冷凍樣本分裝操作。一款是桌面型半自動(dòng)化儀器，可容納并處理市面上大部分的樣品管規(guī)格，適合于較小規(guī)模的試驗(yàn)性研究面上大部分的樣品管規(guī)格，適合于較小規(guī)模的試驗(yàn)性研究和方法開(kāi)發(fā)工作。另一款是落地式全自動(dòng)化操作平臺(tái)，適合標(biāo)準(zhǔn)化流程作業(yè)和以及大群組樣品類(lèi)型的項(xiàng)目型研究工作。兩種儀器都可以處理冷凍的原始糞便樣本，或冷凍的懸浮處理糞樣本，目前正廣泛應(yīng)用于各個(gè)知名的腸道微生物組研究實(shí)驗(yàn)室。

 

 

在當(dāng)前的研究中，收集和處理人類(lèi)糞便樣本用于分析腸道微生物菌群面臨諸多挑戰(zhàn)，不僅在收集流程以及物流運(yùn)輸?shù)陌踩�性上，還有維持樣本呈現(xiàn)在體內(nèi)狀態(tài)時(shí)的分子譜的完整性上，存在著許多難以解決的問(wèn)題。由于每個(gè)排泄物樣本的固化程度、水合作用程度以及組成物質(zhì)有很大的不同，這就給通過(guò)物理手段上處理并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化取定量的樣品進(jìn)行分析造成了很大的困難。又因?yàn)楣腆w顆粒物會(huì)堵塞槍頭，即使研究人員采用糞便懸液樣本，也難以實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)液體自動(dòng)化處理。盡管在轉(zhuǎn)移和處理樣本的準(zhǔn)確度和可重復(fù)性上存在一定的困難，但另一個(gè)更重要的核心問(wèn)題就是如何保持微生物分子生物方面的完整，因?yàn)榧S便樣本中充滿(mǎn)了大量核酸酶和RNA酶，他們的存在使得RNA和元基因組的分析變得更為困難。

 

通過(guò)消除反復(fù)凍融的操作，保持活體微生物遺傳圖譜特性。

冷凍取樣技術(shù)可整合到基因組研究的工作流程中，提高研究效率，最大限度地提高樣本存儲(chǔ)率。

可對(duì)原始樣本進(jìn)行重復(fù)取樣，無(wú)需進(jìn)行反復(fù)凍融即可滿(mǎn)足對(duì)樣品進(jìn)行冷凍分裝的需求。

 

為了使糞便樣本中的核酸含量保持穩(wěn)定，科學(xué)家們已經(jīng)嘗試了多種不同的方法，包括加入復(fù)合種類(lèi)的酶抑制劑、在緩沖液中添加lOOmM的EDTA、還原劑以及乙醇混合物，低溫凍存樣本甚至對(duì)樣品進(jìn)行凍干處理。

 

針對(duì)以上困難，我們提出了一種全新的樣本處理方法，可以在盡量保證樣本遺傳信息完整性和降低分子譜變化的潛在風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)冷凍樣本取樣，在分析之前，我們可以讓樣本在處理、轉(zhuǎn)移和存儲(chǔ)的整個(gè)過(guò)程中保持冷凍狀態(tài)，從而保持糞便樣本的分子譜完整性。此外，通過(guò)冷凍取樣技術(shù)，我們可真正實(shí)現(xiàn)半自動(dòng)化／全自動(dòng)化技術(shù)來(lái)處理更多的糞便樣本，最大限度地避免操作人員暴露于潛在的有害物質(zhì)中，進(jìn)一步規(guī)范作業(yè)流程。例如像瑞士洛桑聯(lián)邦理工大學(xué)(EPFL)的雀巢健康科學(xué)院和盧森堡聯(lián)合生物樣本庫(kù)(IBBL)等實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功地將半自動(dòng)桌面型冷凍取樣技術(shù)應(yīng)用于他們的腸道微生物組的研究工作中。法國(guó)國(guó)家農(nóng)業(yè)研究院(INRA)則在其大型研究項(xiàng)目工作中采用了全自動(dòng)化的技術(shù)方案（CXT750冷凍樣品取樣儀），實(shí)現(xiàn)了樣本處理和存儲(chǔ)工作流程的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。

 

圖1：冷凍樣品取樣儀與法國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院(INRA)糞便微生物菌群研究流程進(jìn)行整合

 

圖2：冷凍樣品取樣和人工取樣的冷凍糞便樣本的宏基岡組比較   在宏基因組分析處理之前，按照以下三個(gè)條件，對(duì)II名志愿者的糞便樣本進(jìn)行處理。條件1：人工分裝的冷凍糞便樣本，和來(lái)自經(jīng)過(guò)固定、均相并在室溫下放置了一周后的進(jìn)行冷凍分裝樣本進(jìn)行比較：條件2：將手動(dòng)取樣的冷凍糞便樣本與穩(wěn)定的、均勻的、在環(huán)境溫度下貯存l周的經(jīng)冷凍取樣的糞便樣本進(jìn)行對(duì)比：條件3：人工分裝的冷凍糞便樣本，和來(lái)自經(jīng)過(guò)固定、均相并在-80℃存放一周后的進(jìn)行冷凍分裝樣本進(jìn)行比較。對(duì)每個(gè)條件下的樣本進(jìn)行測(cè)序，并使用Spea rman軟件進(jìn)行宏基因組的數(shù)據(jù)比較分析，以比較并確定每種取樣技術(shù)的差異。所有條件都顯示出高分值的相關(guān)性(>0 8)。其中，條件3相關(guān)性最佳，條件1相關(guān)性最差。

 

 

任何腸道微生物研究工作的起點(diǎn)都是從患者和志愿者那里收集糞便樣本，收集方法會(huì)根據(jù)操作流程和容器的不同而有所差異。考慮到研究項(xiàng)目的性質(zhì)、規(guī)模以及存儲(chǔ)要求，樣本會(huì)被保存為原始狀態(tài)或者進(jìn)行懸浮處理。考慮到收集容器的類(lèi)型和采集后的樣本制備，冷凍樣品取樣技術(shù)能夠處理大部分類(lèi)型的冷凍糞便樣本規(guī)格。CXT350冷凍樣品取樣儀擅長(zhǎng)處理大多數(shù)類(lèi)型的樣品收集容器，從2.0毫升小型凍存管到50ml的大型離心管，都可以快速進(jìn)行設(shè)置，以適應(yīng)當(dāng)目前種規(guī)格的管型。CXT750冷凍樣品取樣儀可以實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化的冷凍樣本處理，適用于分析通量要求更高的作業(yè)環(huán)境。如果在樣本收集時(shí)或者收集后立即對(duì)樣本進(jìn)行懸浮化或標(biāo)準(zhǔn)化處理，CXT 750將在標(biāo)準(zhǔn)化工作流程和集中存儲(chǔ)的實(shí)施過(guò)程中，成為強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)工具。

 

一般而言，冷凍糞便樣本可以根據(jù)需要隨時(shí)進(jìn)行提取樣，而母樣則始終保持在冷凍狀態(tài)（以供日后研究）。另外一種辦法是，根據(jù)預(yù)先計(jì)劃的研究項(xiàng)目需要或樣本庫(kù)建立/規(guī)格重排的需要，母樣本可直接被冷凍取樣等分為若干數(shù)量的子樣本，方便日后使用。

 

該方法僅在無(wú)需對(duì)母樣本進(jìn)行保留時(shí)使用。

 

無(wú)論是否采用冷凍取樣方法，在沒(méi)有多次的反復(fù)凍融的情況下，冷凍取出的樣本都可直接用于大多數(shù)核酸提取工作。法國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院的研究人員近期通過(guò)冷凍取樣技術(shù)，驗(yàn)證了這一技術(shù)在糞便/腸道微生物研究領(lǐng)域的作用（參見(jiàn)圖1）。法國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院將冷凍取樣技術(shù)與之前的取樣方法進(jìn)行對(duì)比，進(jìn)一步研究這一新技術(shù)是否適用于他們擬實(shí)施的研究項(xiàng)目。

 

 

經(jīng)大量研究證實(shí)：我們的腸道菌群與健康、疾病之間存在著復(fù)雜的相互關(guān)聯(lián)，所以，腸道微生物組研究的重要性正變得越來(lái)越明顯。由于越來(lái)越多的證據(jù)可以證明：不同的腸道微生物菌群的形態(tài)與診斷、預(yù)后之間存在著極強(qiáng)的相關(guān)性，甚至是因果關(guān)系，科學(xué)家們因此也越加關(guān)注這一領(lǐng)域的研究。因此，涉及人類(lèi)糞便樣本采集和分析的研究越來(lái)越多，規(guī)模也越來(lái)越大。目前，在人體腸道微生物菌群的研究中，想要有效和安全地處理大量半固態(tài)或懸浮態(tài)糞便樣本，冷凍樣品取樣技術(shù)是唯一可行的解決方案。

 

1該資料和數(shù)據(jù)由法國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院(INRA )MetaGenoPolis項(xiàng)日的Joel Dore博上提供。

 

可容納并處理市面上大部分的樣品管規(guī)格，亦可根據(jù)需要進(jìn)行定制，最大限度地提高了在實(shí)際應(yīng)用中的靈活性。

 

通過(guò)消除反復(fù)凍融的操作，保持活體微生物遺傳圖譜特性。

 

冷凍取樣技術(shù)可整合到基因組研究的工作流程中，提高研究效率，最大限度地提高樣本存儲(chǔ)率。