慢病毒用于體外（in vitro）實(shí)驗(yàn)：感染培養(yǎng)原代細(xì)胞和建系細(xì)胞

1. 慢病毒對各種細(xì)胞和組織的親嗜性不同，用戶使用Invabio提供的慢病毒之前可以通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，了解慢病毒對您的目的細(xì)胞的親嗜性，感染復(fù)數(shù)（MOI 值）以及在體內(nèi)（in vivo）注射所需要的病毒量。如果沒有相關(guān)文獻(xiàn)支持，可以通過感染預(yù)實(shí)驗(yàn)得到合適的感染復(fù)數(shù)（MOI 值）（使用24孔板檢測病毒對目的細(xì)胞的親嗜性）

① 慢病毒感染目的細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

A． 測定慢病毒對目的細(xì)胞的親嗜性時，需要同時設(shè)置對慢病毒親嗜性較高的（HEK293T，Hela） 細(xì)胞作為平行實(shí)驗(yàn)的對照細(xì)胞。

B．在進(jìn)行慢病毒感染實(shí)驗(yàn)時,可以用完全培養(yǎng)基（培養(yǎng)目的細(xì)胞用）稀釋；理論上，含有血清、雙抗或者其他營養(yǎng)因子的完全培養(yǎng)基不影響慢病毒的感染效率。

C．Invabio提供的病毒單位為TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒顆粒數(shù)。如：病毒滴度為>1X10⁸ TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X10⁸個具有生物活性的慢病毒顆粒。

 

② 以24孔培養(yǎng)板為例，進(jìn)行目的細(xì)胞和HEK293T 細(xì)胞的感染預(yù)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)前按照不同的MOI設(shè)置不同的感染孔，并根據(jù)MOI和細(xì)胞數(shù)量計(jì)算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者無血清培養(yǎng)基稀釋病毒原液

第一天，準(zhǔn)備細(xì)胞：在24孔培養(yǎng)板接種若干孔，每個孔內(nèi)接種3~5X10⁴個目的細(xì)胞，鋪板時細(xì)胞的融合率為50%左右，每孔培養(yǎng)基體積為100 μl；進(jìn)行病毒感染時細(xì)胞的融合度約為70%左右。

 

第二天，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，如細(xì)胞狀態(tài)較好則開始實(shí)驗(yàn)：

1、取出4℃保存的病毒，使用臺式離心機(jī)離心20 秒（使病毒完全懸于離心管底部即可）；如果是凍存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況將按照MOI 準(zhǔn)確計(jì)算好的慢病毒稀釋到培養(yǎng)基中，并盡可能保證所獲得的含有慢病毒的培養(yǎng)基的總體積為最小體積，以期獲得最佳的感染效率。

 

2、病毒準(zhǔn)備好之后，從培養(yǎng)箱中拿出細(xì)胞，

a 使用移液器吸取準(zhǔn)確體積的病毒液加入準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基

b 吸去原細(xì)胞培養(yǎng)器皿中的培養(yǎng)基（如果細(xì)胞生長良好，密度適宜，則不用換液）

c 在目的細(xì)胞和對照細(xì)胞中分別加入計(jì)算好的病毒液

d 混勻后放于二氧化碳培養(yǎng)箱（37℃、5%CO₂）孵育過夜

 

注：感染前細(xì)胞的狀態(tài)好壞對最終的感染效果高低影響很大，所以務(wù)必保證加病毒之前，細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)。

 

如果慢病毒對目的細(xì)胞的感染效率偏低，則可以通過提高M(jìn)OI 值來增加其感染效率，但是當(dāng)MOI 高于20 時，我們建議客戶在培養(yǎng)基中加入ploybrene（8 μg/ml左右）來提高病毒的感染效率。

 

第三天，更換培養(yǎng)液：一般在24小時候后將含有慢病毒的培養(yǎng)液更換成正常培養(yǎng)液；在感染后觀察細(xì)胞狀態(tài)，如果慢病毒對細(xì)胞有明顯毒性作用而影響細(xì)胞生長狀態(tài)，可以最短在加病毒4小時候更換新鮮培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)（建議在8-12小時更換為宜）。第一次換液后，如果慢病毒對細(xì)胞沒有明顯毒性作用，按照正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)換液。

 

第六天，感染效率檢測：在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，估計(jì)慢病毒感染目的細(xì)胞的效率；如何由于目的基因較大而造成選擇的載體不能攜帶Marker Gene的，可以通Real-time RT-PCR檢測目的基因的表達(dá)來拍評估感染效率。