WHITE PAPER: Virotherapy Process Optimization

WHITE PAPER: Virotherapy Process Optimization

采用一系列方法將病毒工程開(kāi)發(fā)用于疾病治療已經(jīng)成為一種新型的應(yīng)用，該應(yīng)用廣泛的定義為病毒療法，包括用于基因治療的病毒載體(Figure 1)和具有溶瘤細(xì)胞功能的病毒(Figure 2)。雖然這些產(chǎn)品大部分都處在臨床開(kāi)發(fā)階段，但是藥物作用靶點(diǎn)的多樣性以及未來(lái)機(jī)會(huì)的財(cái)富都是令人鼓舞的。病毒療法是一門以病毒為基礎(chǔ)的技術(shù)，一個(gè)重要的挑戰(zhàn)就是在任何的時(shí)間點(diǎn)包括早期的研發(fā)，產(chǎn)品的生產(chǎn)，產(chǎn)品的包裝上市都能清楚地了解樣品的質(zhì)量和性能，其中最重要的一點(diǎn)就是病毒的定量。在過(guò)去，病毒的定量依賴于噬斑法和電鏡等方法，這些方法需要大量的勞動(dòng)力，等待很長(zhǎng)時(shí)間才能獲得結(jié)果，且獲得的結(jié)果具有很大的主觀性。然而，以新的病毒學(xué)技術(shù)的多樣性為基礎(chǔ)的病毒藥物和疫苗需要新的分析方法。在這篇文章中，我們將討論病毒計(jì)數(shù)儀3100實(shí)時(shí)的病毒濃度監(jiān)測(cè)功能如何能顯著的促進(jìn)病毒療法產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。

 

Reprogramming Viruses to Treat Disease

基因治療早在十幾年前就已經(jīng)出現(xiàn)，但是因?yàn)槌鲞^(guò)病人死亡的情況而受挫。幸運(yùn)的是，在2006年基因治療在臨床上取得成功，所以基因治療又稱為大家研究的熱點(diǎn)。目前已經(jīng)有2000多個(gè)臨床試驗(yàn)在許多不同的治療領(lǐng)域和標(biāo)志中進(jìn)行或者已經(jīng)完成�；�因治療和其他病毒療法最大的區(qū)別在于基因治療會(huì)將人體的一段健康基因傳遞到病人細(xì)胞中取代一個(gè)非功能性的片段。依賴于此方法，這段健康基因可能會(huì)或者不會(huì)持續(xù)整合到宿主細(xì)胞基因組中。相反，溶瘤細(xì)胞的病毒可以利用許多方法去徹底破壞腫瘤細(xì)胞，而不是改變被感染細(xì)胞的基因組成。溶瘤細(xì)胞病毒療法包括裂解，刺激抗腫瘤免疫反應(yīng)，編碼能激活藥物前體成為有效細(xì)胞毒素的酶，抑制血管生成和放射療法敏化作用。

溶瘤細(xì)胞病毒療法的作用原理和機(jī)制如Figure2所示，該圖為Amgen公司所創(chuàng)，T-VEC 目前被用來(lái)研究黑色素瘤和其他晚期癌癥的治療，使用改進(jìn)的皰疹病毒選擇性感染癌細(xì)胞，分泌細(xì)胞細(xì)胞因子刺激免疫反應(yīng)，已經(jīng)在三期臨床實(shí)驗(yàn)中顯示了顯著的成效。除了癌癥，病毒療法也被建議用來(lái)治療其他疾病，如用噬菌體治療細(xì)菌感染。

到目前為止，許多的病毒已經(jīng)在病毒療法應(yīng)用中被評(píng)估過(guò)（見(jiàn)Table1）。

 

之所以選擇這些病毒，是因?yàn)樗麄冎幻闇?zhǔn)特定的細(xì)胞類型或者適合基因操作。為了把這些病毒開(kāi)發(fā)成基因傳遞載體或者治療因子，必須將這些病毒放大培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中優(yōu)化培養(yǎng)條件以獲得最大的產(chǎn)量。在整個(gè)過(guò)程中如接種，體積放大培養(yǎng)，收樣，純化，濃縮，病毒包裝等都存在延誤、中斷的機(jī)會(huì)。由于許多病毒定量方法都需要好幾天甚至好幾周的時(shí)間，打斷整個(gè)流程，所以病毒定量是一個(gè)大的瓶頸。病毒計(jì)數(shù)儀3100(Figure 3)幾分鐘內(nèi)就能提供精確的，可重復(fù)的病毒顆粒定量結(jié)果，能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)病毒的濃度。96孔板的自動(dòng)上樣系統(tǒng)，為GMP要求設(shè)計(jì)的軟件能很好的滿足大規(guī)模的病毒生產(chǎn)環(huán)境所需的條件。

Figure 3. Virus Counter 3100 (top) and Autosampler (bottom)

Proof of Principle

病毒計(jì)數(shù)儀已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于多種病毒的計(jì)數(shù)，包括基因傳遞載體和溶瘤功能的病毒。這里我們列出一些檢測(cè)的數(shù)據(jù)，證實(shí)病毒計(jì)數(shù)儀快速的病毒定量在病毒療法領(lǐng)域的實(shí)用性。
病毒計(jì)數(shù)儀的精度通過(guò)檢測(cè)系列稀釋的病毒樣品數(shù)據(jù)斜率和線性關(guān)系來(lái)測(cè)量。這個(gè)值越接近1，說(shuō)明這個(gè)機(jī)器產(chǎn)生的數(shù)據(jù)越可信，越能反映病毒濃度的真實(shí)性。

Figure 4證實(shí)了這個(gè)實(shí)驗(yàn)，在這個(gè)案例中檢測(cè)的是水痘病毒。3個(gè)不同的樣品分別檢測(cè)了11稀釋度，斜率分別為－1.0845，－1.0846，－1.14，R2分別是0.995, 0.997 and 0.996，顯示出良好的精確性。
Figure 4. Quantification of serial dilutions of Vaccinia virus usingthe Virus Counter.

在下一個(gè)例子中，一個(gè)客戶想跟蹤HeLa細(xì)胞培養(yǎng)的麻疹病毒的濃度。他們采用病毒計(jì)數(shù)儀測(cè)量總的病毒顆粒，用TCID50（這個(gè)方法需要5-7天的時(shí)間）測(cè)量病毒的感染性,并比較了兩者之間的關(guān)系（Figure5）。與大部分的病毒類似，有感染能力的麻疹病毒的數(shù)量只是總的病毒群體中的一小部分，在這個(gè)例子中只有0.6% to 1.7%，暗示了此批次培養(yǎng)的病毒大部分是非感染性的病毒。有趣的是，在病毒感染后，細(xì)胞培養(yǎng)了120多個(gè)小時(shí)后，感染性病毒數(shù)量明顯下降，而病毒總量卻保持穩(wěn)定不變，暗示病毒的感染效力會(huì)受到培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)的不利影響。

Figure 5. Comparison of total particle count (Virus Counter) andinfectivity (TCID50) of Measels virus grown in HeLa cells.

此外，利用病毒計(jì)數(shù)儀跟蹤定量麻疹病毒在純化的每個(gè)步驟中病毒顆粒的濃度（Figure 6）該實(shí)驗(yàn)闡明了病毒的實(shí)時(shí)定量在病毒純化優(yōu)化，避免錯(cuò)誤發(fā)生的重要性。沒(méi)有病毒計(jì)數(shù)儀的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，任何人在生產(chǎn)病毒療法的藥劑時(shí)都是在黑暗中摸索，冒著百萬(wàn)美元損失以及需要安全有效產(chǎn)品進(jìn)行治療的病人的健康風(fēng)險(xiǎn)。

Figure 6. Tracking virus particle counts during harvest and purification.

 
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