轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)

         楊云霞 1  蔣士強(qiáng)2  趙明1  董志強(qiáng)1

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因食品 轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品 食品安全 生物技術(shù) 檢測(cè)技術(shù)

Abstract:  discuss on the question Genetically modified crops and Genetically modified food safety are discussed. The method of detection from gene and gene translation and gene express is given.
      Key words: Genetically modified crops   Genetically modified food  food Safety   biotechnology  Detection technology

隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展、基因工程技術(shù)已在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中得到廣泛運(yùn)用。自二十世紀(jì)八十年代以來(lái)以基因改良為核心的農(nóng)業(yè)生物技術(shù)正掀起第二次綠色革命。運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)（Gene transfer）能培育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病蟲(chóng)害、抗逆的優(yōu)良品種，以緩解由于人口迅速增長(zhǎng)、可耕地的減少、資源短缺、環(huán)境惡化而帶來(lái)的農(nóng)牧產(chǎn)品和食品短缺的危機(jī)。以農(nóng)作物為例〔1〕自1994年第一例轉(zhuǎn)基因延熟西紅柿在美國(guó)批準(zhǔn)上市以來(lái)，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積迅猛擴(kuò)大，由1996年的170萬(wàn)公頃增長(zhǎng)到2002年的5870萬(wàn)公頃。轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)品的全球銷售額由1995年的0.75億美元、1999年激增到21～23億美元,預(yù)測(cè)2005年將達(dá)到80億美元，2010年將突破250億美元〔2〕。

轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品、食品的安全性問(wèn)題

1.轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品、食品引發(fā)的安全性思考

隨著轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品、食品的迅猛增加，雖然其具有優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)等諸多優(yōu)點(diǎn)，但由于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品和食品是把一種外源基因片斷轉(zhuǎn)移到目的物種中，從而改變目的物種的性狀，特別是1998年發(fā)生的英國(guó)蘇格蘭Rowett研究所的Pusztai事件，雖后來(lái)被否定〔3〕，但接著1999年又發(fā)生的美國(guó)康奈爾大學(xué)Losey等報(bào)道的帝王蝶〔4〕事件至今尚在進(jìn)一步驗(yàn)證之中。而巴西堅(jiān)果蛋白質(zhì)與其轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)人引起類似的過(guò)敏反應(yīng)等事件，使人們對(duì)轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品、食品的安全性提出眾多質(zhì)疑，例如：外源基因是否安全? 基因結(jié)構(gòu)是否穩(wěn)定且會(huì)不會(huì)產(chǎn)生有害人體健康的突變?基因轉(zhuǎn)入后是否產(chǎn)生新的有害遺傳性狀或不利健康成分? 營(yíng)養(yǎng)成分和其它功能性是否改變？轉(zhuǎn)基因的標(biāo)記基因是否會(huì)使人產(chǎn)生抗藥基因? 是否會(huì)增加食物的過(guò)敏源〔5〕……消費(fèi)者從自身健康考慮，提出轉(zhuǎn)基因食品安全問(wèn)題是非常自然的。轉(zhuǎn)基因食品的安全性問(wèn)題，已引發(fā)全球爭(zhēng)論，對(duì)轉(zhuǎn)基因食品這一新生事物做好安全性檢測(cè)和評(píng)估是非常必要的。 安全性評(píng)估主要包括有無(wú)毒性、有無(wú)過(guò)敏性以及抗生素抗性等標(biāo)記基因的安全性。世界各國(guó)人們都在呼吁對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行科學(xué)的評(píng)估。

2. 實(shí)質(zhì)等同性原則〔6〕

目前對(duì)食品安全性的評(píng)估均采用世界經(jīng)濟(jì)發(fā)展合作組織（OECD）1993年提出的實(shí)質(zhì)等同性原則，即通過(guò)生物技術(shù)得到的轉(zhuǎn)基因食品是否與目前市售常規(guī)食品有實(shí)質(zhì)性的等同：⑴生物技術(shù)食品與傳統(tǒng)食品有實(shí)質(zhì)性等同。由于經(jīng)過(guò)了長(zhǎng)期的自然選擇，機(jī)體已經(jīng)對(duì)該種物質(zhì)具有了良好的適應(yīng)性，人類和自然環(huán)境對(duì)其也已經(jīng)接受，對(duì)此類產(chǎn)品可不必進(jìn)行安全檢測(cè)與評(píng)估。⑵轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品與傳統(tǒng)產(chǎn)品除某一插入的特定性狀外，與非轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物具有實(shí)質(zhì)等同性。對(duì)這類轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)應(yīng)主要集中在對(duì)插入基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)上，不必過(guò)分強(qiáng)調(diào)分析其他性狀，也不必考慮DNA和mRNA本身是否有毒性，因?yàn)樗�有生物體的DNA構(gòu)件元素都是一樣的。⑶轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品與傳統(tǒng)產(chǎn)品沒(méi)有實(shí)質(zhì)的等同性且市場(chǎng)上沒(méi)有與轉(zhuǎn)基因食品相對(duì)應(yīng)的傳統(tǒng)產(chǎn)品，對(duì)該類產(chǎn)品則要求進(jìn)行詳細(xì)的安全性檢測(cè)和評(píng)估，包括有無(wú)天然有毒物質(zhì)、有無(wú)營(yíng)養(yǎng)成分和抗?fàn)I養(yǎng)因子、有無(wú)過(guò)敏源、轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定性和插入突變、基因的多效性和次級(jí)效應(yīng)等。

3. 世界各國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的認(rèn)識(shí)和態(tài)度

美國(guó)是轉(zhuǎn)基因食品的積極倡導(dǎo)者，美國(guó)公民對(duì)轉(zhuǎn)基因食品采取比較寬容的態(tài)度，其轉(zhuǎn)基因作物的播種面積一直占據(jù)全世界的首位。他們認(rèn)為轉(zhuǎn)基因食品在上市之前要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的市場(chǎng)準(zhǔn)入檢測(cè)，在實(shí)質(zhì)上和傳統(tǒng)的食品沒(méi)有什么區(qū)別即可上市。美國(guó)由FDA、EPA、USDA負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)基因食品的評(píng)價(jià)、檢測(cè)和監(jiān)控。這些機(jī)構(gòu)與聯(lián)合國(guó)糧食組織（FAD）、世界衛(wèi)生組織（WHO）和美國(guó)國(guó)家科學(xué)院（NAS）對(duì)新食品管理的原則是一致的〔7〕。

歐盟對(duì)轉(zhuǎn)基因食品持比較謹(jǐn)慎的態(tài)度，政府反對(duì)美國(guó)轉(zhuǎn)基因食品涌入自己的國(guó)家。他們認(rèn)為轉(zhuǎn)基因食品通過(guò)生物技術(shù)將其他動(dòng)物、植物、微生物的一段異源基因不定點(diǎn)插入目的食品，打破生物種間的界限會(huì)破壞自然的食品構(gòu)成體系，造成基因水平的混亂，可能會(huì)導(dǎo)致一些遺傳學(xué)或營(yíng)養(yǎng)成分的非預(yù)期改變，從而危害人們的健康。同時(shí)也認(rèn)為轉(zhuǎn)基因食品的新組合和性狀在不同遺傳背景下表達(dá)，人們還缺乏其對(duì)環(huán)境、人類影響的認(rèn)識(shí)，加之應(yīng)用于生產(chǎn)和消費(fèi)的時(shí)間還很短，不能拿出足夠的證據(jù)來(lái)證明轉(zhuǎn)基因食品對(duì)人的身體是完全安全的。但其中也不乏帶有政治色彩的屬于貿(mào)易壁壘的抵制。歐盟1996年制定的食品標(biāo)簽法規(guī)規(guī)定必須對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行標(biāo)簽標(biāo)注。在管理上分橫向的與技術(shù)相關(guān)的法規(guī)和縱向的與產(chǎn)品相關(guān)的法規(guī)〔8〕。

中東一些國(guó)家由于宗教的影響從社會(huì)倫理方面考慮對(duì)轉(zhuǎn)基因食品比較排斥。南美、日本、韓國(guó)等屬于比較中立的國(guó)家對(duì)轉(zhuǎn)基因食品不像歐盟那樣排斥也不像美國(guó)那樣認(rèn)可，他們都開(kāi)始了轉(zhuǎn)基因食品安全性的試驗(yàn)研究。我國(guó)既積極支持轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究同時(shí)對(duì)對(duì)轉(zhuǎn)基因食品采取比較謹(jǐn)慎的態(tài)度，認(rèn)同國(guó)際上通行的轉(zhuǎn)基因食品的實(shí)質(zhì)等同性原則。我國(guó)國(guó)家科委1993年頒布了《基因工程安全辦法》，1996年農(nóng)業(yè)部正式實(shí)施《農(nóng)業(yè)生物基因工程安全性管理法規(guī)》，對(duì)轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品從試驗(yàn)研究、中間試驗(yàn)、環(huán)境釋放到最后的商品化全過(guò)程進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)、并制定了相應(yīng)的監(jiān)督檢測(cè)措施。2002年3月，正式實(shí)施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)管理辦法》和《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》。這些政策和法規(guī)的頒布與實(shí)施對(duì)人們食用轉(zhuǎn)基因食品提供了有力的保障�！�9〕

轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)方法

鑒于全世界對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的安全性引起的關(guān)注和激烈爭(zhēng)論，對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)顯得尤為重要�；�因工程技術(shù)是將克隆的外源基因通過(guò)基因槍法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等方法轉(zhuǎn)入目的農(nóng)作物中、使目的農(nóng)作物中具有外源基因所具有的優(yōu)良性狀。對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)、從轉(zhuǎn)基因技術(shù)本身來(lái)分析、可從基因水平、基因轉(zhuǎn)錄水平和基因翻譯產(chǎn)物水平進(jìn)行。

1. 基因水平的檢測(cè)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)將從各種生物中克隆出來(lái)的目的基因片斷插入到靶向受體中時(shí)，一般要構(gòu)建啟動(dòng)子、終止子、選擇標(biāo)記基因、報(bào)告基因等。從基因水平進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)就是要檢測(cè)受體的核酸序列、目的片斷的整合位點(diǎn)、基因多態(tài)性、目的片斷的含量分析以及啟動(dòng)子、終止子、選擇標(biāo)記基因、報(bào)告基因等。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction） PCR法〔10〕

對(duì)報(bào)檢的樣品運(yùn)用PCR儀，針對(duì)外源基因設(shè)計(jì)合適的引物，通過(guò)TaqDNA酶的聚合快速特異地?cái)U(kuò)增目的基因片段，使目的基因片斷以數(shù)量級(jí)速度在體外得到擴(kuò)增從而可以在短短的幾小時(shí)內(nèi)使Pg水平的特異外源DNA片段擴(kuò)增到ng乃至ug水平，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酞胺凝膠電泳，用溴化乙錠（EB）染色，在紫外光下就可觀察到外源目的片斷。

(1) 定性PCR法

定性PCR可直接檢測(cè)啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因片斷、目的基因片斷。為使目的基因很好的進(jìn)行表達(dá)，在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)常在目的基因的5’和3’端分別加上啟動(dòng)子和終止子。當(dāng)前大約75%的轉(zhuǎn)基因植物中使用Ca MV( Cauliflower mosaicvirus) 3 5 S啟動(dòng)子，其次是胭脂堿和章魚(yú)堿合成酶的NOS啟動(dòng)子和Ocs啟動(dòng)子。常用的終止子是胭脂堿合成酶的NOS終止子和Rubisco小亞基基因的3’端區(qū)域、所以當(dāng)前對(duì)啟動(dòng)子和終止子的檢測(cè)實(shí)際上是對(duì)Ca MV35S啟動(dòng)子和NOS終止子的檢測(cè)。然而一些植物如十字花科植物易被CaMV感染而攜帶35S，故檢測(cè)出陽(yáng)性信號(hào);而NOS終止子來(lái)源于普遍存在的農(nóng)桿菌(Agrobacterium tume faciens )，因此，用PCR對(duì)35S啟動(dòng)子和NOS終止子進(jìn)行檢測(cè)時(shí)應(yīng)配合其他檢測(cè)。定性PCR受DNA抽提和純化的影響，如果DNA降解或受污染，檢測(cè)結(jié)果就會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象；只能初步確定是否為GMF但不能鑒定是哪種GMF。

(2) 定量PCR法

在實(shí)際貿(mào)易和食品消費(fèi)中我們不僅想知道食品是否是轉(zhuǎn)基因的，而且還想知道其中外源基因的含量，即外源基因占GMF的百分含量。在普通的定性PCR擴(kuò)增過(guò)程中，以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品作參照，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性物用基因工程方法合成，上游引用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記，在模板擴(kuò)增的同時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性物也被擴(kuò)增。。最后根據(jù)吸光值作出吸光值與轉(zhuǎn)基因含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，以此可以確定檢測(cè)樣品的轉(zhuǎn)基因含量，這樣可以進(jìn)行半定量檢測(cè)。

(3) 定量競(jìng)爭(zhēng)性 QC一PCR法(Quantitative competitive PCR) 

在PCR的反應(yīng)管中，同時(shí)放入用人工合成用熒光標(biāo)記的模板和待測(cè)樣品讓兩者對(duì)同一引物同時(shí)擴(kuò)增，反應(yīng)完成后通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度推測(cè)待測(cè)樣品的DNA含量。

(4) 實(shí)時(shí)定量熒光PCR法〔11〕

實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，添加一條熒光標(biāo)記基因探針（一般為Taq man）。一個(gè)標(biāo)記在探針的5'端，一個(gè)標(biāo)記在探針的3'端，兩者構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)，兩個(gè)熒光集團(tuán)根據(jù)距離控制是吸收或抑制，在PCR不斷擴(kuò)增中不斷檢測(cè)反應(yīng)體系中熒光信號(hào)的變化，通過(guò)記錄循環(huán)次數(shù)和PCR體系中起始DNA量的對(duì)數(shù)值之間的線性關(guān)系確定起始DNA的量。用實(shí)時(shí)定量熒光PCR對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行檢測(cè)可避免普通PCR反應(yīng)過(guò)程中由于外界污染或樣品本身DNA降解等原因造成的假陽(yáng)性結(jié)果，但是實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀價(jià)格昂貴，檢測(cè)費(fèi)用高。

(5)反轉(zhuǎn)錄RT-PCR法

 反轉(zhuǎn)錄PCR克服了待檢樣品中外源基因含量特別微量，以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再通過(guò)PCR擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)。

(6) PCR—ELISA法

PCR一ELISA是I種將PCR高效性與ELISA高特異性結(jié)合在一起的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法。利用共價(jià)交聯(lián)在PCR管壁上的寡核普酸作為固相引物，在Taq酶作用下，以目標(biāo)核酸為模板進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物一部分交聯(lián)在管壁上，為固相產(chǎn)物，一部分游離于液體中，為液相產(chǎn)物。對(duì)于固相產(chǎn)物，可用標(biāo)記探針與之雜交，再用堿性磷酸酷酶標(biāo)記的鏈親和素進(jìn)行ELISA檢測(cè)，同時(shí)可通過(guò)凝膠電泳對(duì)液相產(chǎn)物進(jìn)行分析。將PCR和ELISA兩種方法相結(jié)合，可以相互取長(zhǎng)補(bǔ)短，使檢測(cè)的準(zhǔn)確性大大提高。目前在我國(guó)尚未建立統(tǒng)一完備的轉(zhuǎn)基因食品的篩選方法，隨著轉(zhuǎn)基因食品的數(shù)量增多及我國(guó)加入世界貿(mào)易組織，在我國(guó)建立轉(zhuǎn)基因食品的篩選方法將對(duì)人群健康及生態(tài)環(huán)境的保護(hù)起積極的作用。

Southern雜交

Southern雜交技術(shù)在分子生物學(xué)中用于基因組DNA特定序列定位。在轉(zhuǎn)基因食品中用Southern技術(shù)，是要在知道該轉(zhuǎn)基因食品轉(zhuǎn)入外源基因片斷的情況下使用。以放射性或熒光標(biāo)記的外源目的基因的同源序列作為探針與該食品原料農(nóng)產(chǎn)品的總DNA進(jìn)行雜交。首先用限制酶消化受體總DNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳按大小分離所得的片斷，隨后使DNA在原位發(fā)生變性，并從凝膠轉(zhuǎn)移至一固相支持體上。DNA轉(zhuǎn)移至固相支持體的過(guò)程中，各個(gè)DNA片斷的相對(duì)位置保持不變，用放射性或熒光標(biāo)記的探針與各個(gè)DNA片斷雜交，經(jīng)放射自顯影確定與探針互補(bǔ)的電泳條帶的位置。Southern技術(shù)用于食品外源基因的檢測(cè)可檢測(cè)出外源基因與內(nèi)源基因有高度同源性的DNA片斷，且準(zhǔn)確可靠，但對(duì)樣品的純度要求較高，費(fèi)用也較高。

基因芯片

基因芯片〔12〕是20世紀(jì)80年代末在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)高新技術(shù)，是由大量DNA或寡核苷酸探針密集排列的矩陣，基因芯片可以將目前通用的報(bào)告基因、抗性基因、啟動(dòng)子和終止子的特異片段(靶片段)固定于玻片上制成檢測(cè)芯片，將從待檢樣品中提取的DNA擴(kuò)增、標(biāo)記后與芯片進(jìn)行雜交，雜交信號(hào)由芯片掃描儀檢測(cè)，再經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行分析判斷,其基本原理為通過(guò)雜交檢測(cè)信號(hào)�；�因芯片技術(shù)可對(duì)樣品進(jìn)行集約化和平行處理。利用基因芯片可實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)。從而方便、快速地對(duì)大量待檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)。        

其不足之處是每種檢測(cè)樣品首先必須有與之相配的非轉(zhuǎn)基因作物的芯片。

 2. 基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)

northern印跡雜交

將northern技術(shù)用于外源基因的測(cè)定可測(cè)定特定外源基因DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA分子的大小和豐度。RNA分子在變性瓊脂糖凝膠中按其大小不同而相互分開(kāi)，隨后將RNA轉(zhuǎn)移至活化纖維素、硝酸纖維素濾膜上。用放射性標(biāo)記的外源DNA探針或RNA探針進(jìn)行雜交和放射自顯影，確定外源DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA。

3. 基因翻譯表達(dá)水平的檢測(cè)

1. 酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(EL ISA)技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(E nzy me一Linked Immunosorbent Assay, EL ISA)用于檢測(cè)表達(dá)的目的蛋白，其基本原理是抗原抗體的特異性結(jié)合和酶對(duì)底物的高效催化。將針對(duì)目的蛋白的抗體包被在ELISA板上，加入待測(cè)物的溶液，經(jīng)保溫如待測(cè)物中含有轉(zhuǎn)基因片斷的表達(dá)產(chǎn)物即相應(yīng)的蛋白，該蛋白作為抗原與包被的特異性抗體相結(jié)合。加入酶標(biāo)記的針對(duì)目的蛋白的抗體，再經(jīng)保溫后加入酶反應(yīng)底物顯色，以酶聯(lián)閱讀儀測(cè)定OD值。

2. 蛋白芯片

蛋白芯片的操作過(guò)程和基因芯片是一樣的，只是其原理是利用抗原抗體的特異性結(jié)合而不是堿基對(duì)的互補(bǔ)雜交。

3. Westertern印跡法

Western印跡法的原理和Southern雜交、northern印跡雜交的原理相似，是抗原抗體的特異性結(jié)合。把從樣品中提取的蛋白質(zhì)用凝膠電泳分離成大小不同的分子作為抗原，并將其轉(zhuǎn)移到固體支持物上，用含有放射性標(biāo)記的抗體做探針與之雜交，通過(guò)放射性自顯影檢測(cè)外源基因的表達(dá)產(chǎn)物。Western印跡法與EL ISA所用都是抗原抗體的特異性結(jié)合，標(biāo)記探針不同而已。一個(gè)為放射性標(biāo)記，一個(gè)為酶標(biāo)記。

轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)的發(fā)展方向和趨勢(shì)

由于轉(zhuǎn)基因食品直接關(guān)系到人們的身體健康和切身利益，所以對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)要求快速、準(zhǔn)確、實(shí)用、操作簡(jiǎn)便。轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)正朝著試劑盒的方向發(fā)展，DNA芯片技術(shù)在未來(lái)的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中的作用也越來(lái)越突出。


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