DNA測(cè)序技術(shù)的前世今生：三代測(cè)序技術(shù)原理、平臺(tái)、特點(diǎn)介紹

人類基因組計(jì)劃、基因芯片、個(gè)性化分子診斷、生物云計(jì)算……這些在21世紀(jì)第一個(gè)十年里吸引無(wú)數(shù)眼球的熱門詞匯，都和一個(gè)產(chǎn)業(yè)頗有淵源——DNA測(cè)序。生物技術(shù)和信息技術(shù)在這片創(chuàng)意新天地里水乳交融，如果用一句詩(shī)來(lái)形容坐擁兩大技術(shù)護(hù)航的DNA測(cè)序產(chǎn)業(yè)，那就是——天生麗質(zhì)難自棄。

隨著人類基因組計(jì)劃的完成，人類對(duì)自身遺傳信息的了解和掌握有了前所未有的進(jìn)步。與此同時(shí)，分子水平的基因檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)不斷發(fā)展和完善，使得基因檢測(cè)技術(shù)得到了迅猛發(fā)展，基因檢測(cè)效率不斷提高。從最初第一代以 Sanger 測(cè)序?yàn)榇�表的直接檢測(cè)技術(shù)和以連鎖分析為代表的間接測(cè)序技術(shù)，到 2005 年，以 Illumina 公司的 Solexa技術(shù)和 ABI 公司的 SOLiD 技術(shù)為標(biāo)志的新一代測(cè) 序 (next-generation sequencing，NGS) 的 相 繼 出現(xiàn)，測(cè)序效率明顯提升，時(shí)間明顯縮短，費(fèi)用明顯降低，基因檢測(cè)手段有了革命性的變化。

DNA測(cè)序技術(shù)經(jīng)歷了不同的發(fā)展階段，本文將重點(diǎn)介紹第一代、第二代、第三代測(cè)序的基本原理、代表性的測(cè)序平臺(tái)以及不同發(fā)展階段的測(cè)序技術(shù)的特點(diǎn)。

第一代測(cè)序技術(shù)

傳統(tǒng)的雙脫氧鏈終止法、化學(xué)降解法以及在它們的基礎(chǔ)上發(fā)展來(lái)的各種DNA測(cè)序技術(shù)統(tǒng)稱為第一代DNA測(cè)序技術(shù)。人類基因組計(jì)劃(human genome project，HGP)主要基于第一代DNA測(cè)序技術(shù)。

雙脫氧鏈終止法

雙脫氧鏈終止法又稱為Sanger法。該方法的原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4種單脫氧核苷三磷酸(dNTP，其中的一種用放射性P32標(biāo)記)存在條件下復(fù)制時(shí)，在四管反應(yīng)系統(tǒng)中分別按比例引入4種雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)，因?yàn)殡p脫氧核苷沒(méi)有3’OH，所以只要雙脫氧核苷摻入鏈的末端，該鏈就停止延長(zhǎng)，若鏈端摻入單脫氧核苷，鏈就可以繼續(xù)延長(zhǎng)。如此每管反應(yīng)體系中便合成以各自的雙脫氧堿基為3’端的一系列長(zhǎng)度不等的核酸片段。反應(yīng)終止后，分4個(gè)泳道進(jìn)行凝膠電泳，分離長(zhǎng)短不一的核酸片段，長(zhǎng)度相鄰的片段相差一個(gè)堿基。經(jīng)過(guò)放射自顯影后，根據(jù)片段3’端的雙脫氧核苷酸，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。

第一代測(cè)序技術(shù)的主要特點(diǎn)是：

• 測(cè)序讀長(zhǎng)可達(dá)1000bp；
• 準(zhǔn)確性高達(dá)99.999%；
• 測(cè)序成本高；
• 通量低。

第二代測(cè)序技術(shù)（NGS）

隨著人類基因組計(jì)劃的完成，人們進(jìn)入了后基因組時(shí)代，即功能基因組時(shí)代，傳統(tǒng)的測(cè)序方法已經(jīng)不能滿足深度測(cè)序和重復(fù)測(cè)序等大規(guī)�；�因組測(cè)序的需求，這促使了新一代DNA測(cè)序技術(shù)的誕生。新一代測(cè)序技術(shù)也稱為第二代測(cè)序技術(shù)，主要包括羅氏454公司的GS FLX測(cè)序平臺(tái)、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer測(cè)序平臺(tái)和ABI公司的SOLID測(cè)序平臺(tái)。

第二代測(cè)序技術(shù)核心思想是邊合成邊測(cè)序（Sequencing by Synthesis)，即通過(guò)捕捉新合成的末端的標(biāo)記來(lái)確定DNA的序列。以Illumina的技術(shù)原理為例做一下說(shuō)明：先在片段DNA兩端臉上接頭，目的是能夠匹配到芯片上的接頭，接著與芯片雜交，進(jìn)行橋式擴(kuò)增，接著簇的形成，是為了保證信號(hào)強(qiáng)度，再加入四種有阻滯劑和熒光標(biāo)記的單核苷酸，如此循環(huán)，記錄每個(gè)循環(huán)的熒光信息，最后得到序列信息。

第二代測(cè)序技術(shù)最顯著的特征是高通量，一次能對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)序，使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序或基因組深度測(cè)序變得方便易行，同時(shí)成本也大大下降。

Illumina測(cè)序流程

第三代測(cè)序技術(shù)

近年來(lái)，測(cè)序技術(shù)取得了新的進(jìn)展，發(fā)展到第三代測(cè)序。第三代測(cè)序技術(shù)的核心理念是以單分子為目標(biāo)的邊合成邊測(cè)序。該技術(shù)不需要經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了對(duì)每一條DNA分子的單獨(dú)測(cè)序。代表性的測(cè)序平臺(tái)有PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies納米孔單分子測(cè)序技術(shù)。

其中PacBio SMRT技術(shù)其實(shí)也應(yīng)用了邊合成邊測(cè)序的思想，并以SMRT芯片為測(cè)序載體�；�本原理是： DNA聚合酶和模板結(jié)合，4色熒光標(biāo)記 4 種堿基（即是dNTP），在堿基配對(duì)階段，不同堿基的加入，會(huì)發(fā)出不同光，根據(jù)光的波長(zhǎng)與峰值可判斷進(jìn)入的堿基類型。同時(shí)這個(gè) DNA 聚合酶是實(shí)現(xiàn)超長(zhǎng)讀長(zhǎng)的關(guān)鍵之一。SMRT技術(shù)的測(cè)序速度很快，每秒約10個(gè)dNTP。

三代測(cè)序設(shè)備在DNA 序列片段讀長(zhǎng)上優(yōu)于二代設(shè)備，但在準(zhǔn)確度上較二代設(shè)備差，未來(lái)隨著技術(shù)的改善，三代測(cè)序設(shè)備將更為穩(wěn)定和成熟。

PacBio SMRT測(cè)序原理

DNA測(cè)序技術(shù)經(jīng)過(guò)30多年的發(fā)展，目前已經(jīng)到了第三代，三代測(cè)序技術(shù)有各自的優(yōu)勢(shì)。未來(lái)，基于不同的測(cè)序的目的，三代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用將各自發(fā)揮功效，同時(shí)測(cè)序成本也將進(jìn)一步下降，測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展也將促進(jìn)生物研究和醫(yī)療應(yīng)用的進(jìn)步。