高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)相關(guān)-鉤吻素子對(duì)大鼠焦慮行為的影響

鉤吻素子對(duì)大鼠焦慮行為的影響

摘要 ： 目的 進(jìn)一步明確鉤吻素子是否具有抗焦慮作用 。 方法 以大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)為動(dòng)物模型 ， 評(píng)價(jià)鉤吻素子單次皮下注射給藥和連續(xù)皮下注射給藥的抗焦慮活性及特點(diǎn) 。 結(jié)果 鉤吻素子能顯著增加大鼠進(jìn)入高架十字迷宮開臂次數(shù)和在開臂的停留時(shí)間百分率（P＜ ０ ． ０５ ，P ＜ ０ ． ０１） ； 鉤吻素子在實(shí)驗(yàn)劑量下對(duì)大鼠自主運(yùn)動(dòng)活性無影響（P ＞ ０ ． ０５） 。 結(jié)論 鉤吻素子可能具有抗焦慮作用 。
關(guān)鍵詞 ： 鉤吻素子 ； 焦慮 ； 高架十字迷宮

焦慮癥（anxiety disorders）又名焦慮障礙，或者焦慮精神性疾病，是一類以發(fā)作性或持續(xù)性情緒焦慮和緊張為主要特征的精神性疾病。焦慮癥的發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量。藥物治療是目前應(yīng)用最廣泛、最有效的治療手段。然而，經(jīng)典的一線抗焦慮藥在治療焦慮癥的同時(shí)，往往具有藥物依賴、鎮(zhèn)靜、性功能障礙等不良反應(yīng) ， 使其臨床應(yīng)用受到限制，因此，亟待研發(fā)有效安全的新型抗焦慮藥。鉤吻為馬錢科胡蔓藤屬植物 ，中國(guó)鉤吻盛產(chǎn)于閩、桂、浙等地，其主要成分為吲哚類生物堿，含有數(shù)十種生物堿單體，其中鉤吻素子（koumine）為國(guó)產(chǎn)鉤吻生物堿單體中含量最高的一種有效成分。本實(shí)驗(yàn)室前期采用小鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)和明暗穿梭箱測(cè)試方法，首次觀察到鉤吻素子具有顯著的抗焦慮作用。然而，鉤吻素子抗焦慮作用有待于在更多的焦慮動(dòng)物模型上確證。本文擬在此基礎(chǔ)上， 采用單次給藥和連續(xù)給藥２種給藥方式，考察鉤吻素子在大鼠高架十字迷宮模型中的抗焦慮作用及其特點(diǎn)。

1 儀器與材料

1.1 儀器  XR-XG201型 大鼠高架十字迷宮（由上海欣軟信息科技有限公司提供）

1．2試藥鉤吻素子粉末，由本課題組分離純化，并經(jīng)高效液相色譜鑒定，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為９９．２％，臨用時(shí)用生理鹽水配成所需質(zhì)量濃度的溶液；地西泮注射液，天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)１０１０１８１，用生理鹽水配成所需質(zhì)量濃度的溶液，新鮮配制。

1．3動(dòng)物清潔級(jí)雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量１８０～２００g，許可證號(hào)：SCXK（滬）２０１２‐０００２，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。在光暗周期１２／１２h（光照時(shí)間８：００～２０：００）、恒濕度（５０％±５％）、恒溫（２４±２℃）環(huán)境飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，每２d換１次墊料，動(dòng)物室保持安靜。實(shí)驗(yàn)前７d每天撫摸大鼠１～２min，減少無關(guān)刺激對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。給藥前１h將大鼠移至實(shí)驗(yàn)室，使之熟悉環(huán)境，消除陌生環(huán)境對(duì)大鼠的影響。所有針對(duì)大鼠的實(shí)驗(yàn)操作均遵守國(guó)際和本地實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和保護(hù)委員會(huì)頒布的條例。

2方法

2．1動(dòng)物分組及給藥大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（生理鹽水）、地西泮（diazepam，DZP）陽性對(duì)照組（０．５mg·kg－１）及鉤吻素子０．７５，１．５和３mg·kg－１劑量組，每組７～１９只大鼠，按０．００５mL·g－１頸背部皮下單次量注射給藥１h后，于９：００～１３：００進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試；另取大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（生理鹽水）、DZP組（０．５mg·kg－１）及鉤吻素子０．１８７５，０．７５，１．５和３mg·kg－１劑量組，每組７～１５例。０．００５mL·g－１，頸背部皮下注射給藥，每天１次，連續(xù)７d（其中DZP組則第１～６d給予等體積生理鹽水，第７d給予DZP０．５mg·kg－１），各組于d７末次給藥１h后于９：００～１３：００進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。
2．2行為學(xué)測(cè)試將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物迅速置于迷宮的中央開闊部，使其頭部正對(duì)其中一個(gè)開臂，通過上方的攝像機(jī)拍攝５min內(nèi)動(dòng)物的活動(dòng)情況，記錄下述指標(biāo)：①封閉臂進(jìn)入次數(shù)（closearmentry，CE）；②開放臂進(jìn)入次數(shù)（openarmentry，OE）；③開放臂停留時(shí)間（openarmtime，OT）。通過以上行為學(xué)指標(biāo)分別計(jì)算下列指標(biāo)：動(dòng)物進(jìn)入開放臂和封閉臂的總次數(shù)（to‐talarmentries）；動(dòng)物進(jìn)入開放臂次數(shù)比例（OE％），即OE／（CE＋OE）×１００％；動(dòng)物在開放臂停留時(shí)間比例（OT％：OT／總時(shí)間×１００％）。
2．3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS１３．０forWindows軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±S．E．M）表示，兩組間均數(shù)比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間采用one‐wayANOVA方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，差異有顯著性時(shí)再用LSD‐posthoc進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜０．０５為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4討論
目前，焦慮動(dòng)物模型包括各種改進(jìn)型多達(dá)３０種以上，其根據(jù)行為模式主要包括兩大類：基于動(dòng)物非條件反射的模型和基于條件反射（傳統(tǒng)學(xué)習(xí)模式）的模型。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)（elevatedplus‐mazetest，EPM）是基于動(dòng)物對(duì)新異環(huán)境的探究特性和對(duì)高懸敞開臂的恐懼形成的動(dòng)物矛盾沖突狀態(tài)的原理，建立的非條件反射模型，是目前應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)動(dòng)物焦慮行為的經(jīng)典模型之一，在精神藥理學(xué)研究中應(yīng)用廣泛。隨著精神藥理學(xué)的發(fā)展，EPM除了用于大鼠、小鼠的焦慮行為，還可用于評(píng)價(jià)同屬于嚙齒類的其他動(dòng)物焦慮行為，如豚鼠。評(píng)價(jià)藥物是否具有抗焦慮作用，需在多種模型上從多個(gè)角度驗(yàn)證。因此，本文選用大鼠高架十字迷宮模型，進(jìn)一步評(píng)價(jià)鉤吻素子的抗焦慮作用。在EPM中，動(dòng)物進(jìn)入開臂次數(shù)和在開臂滯留時(shí)間，充分地反映了動(dòng)物的焦慮狀態(tài)，相比之下，總?cè)氡鄞螖?shù)則反映了動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)活性。同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)基于動(dòng)物非條件反射行為基礎(chǔ)建立的EPM模型，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中很容易被實(shí)驗(yàn)條件影響，例如：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇（種屬、年齡、性別、健康狀態(tài)）、動(dòng)物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)、實(shí)驗(yàn)條件基本保持一致（實(shí)驗(yàn)操作者、燈光、氣味）、飼養(yǎng)條件、測(cè)試時(shí)間等。地西泮是經(jīng)典的苯二氮類抗焦慮藥物，其起效快，作用顯著，是焦慮動(dòng)物模型中最常用的陽性對(duì)照藥之一，在單次給藥和連續(xù)給藥EPM模型中，我們均可觀察到地西泮能夠顯著提高動(dòng)物開臂的進(jìn)入次數(shù)以及在開放臂的停留時(shí)間，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，說明模型穩(wěn)定。

有研究指出，北美鉤吻總生物堿在劑量為１５０mg·kg－１時(shí)，能顯著性地提高小鼠在高架十字迷宮中進(jìn)入開放臂的次數(shù)和時(shí)間。在小鼠明暗穿箱實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，北美鉤吻總生物堿能顯著提高小鼠在明箱中的停留時(shí)間和明暗箱穿梭次數(shù)，顯示出顯著的抗焦慮作用。鉤吻生物堿單體鉤吻素甲和鉤吻素子在小鼠明暗穿箱模型中，也顯示出顯著的抗焦慮作用。此外，鉤吻素子與其他鉤吻生物堿單體相比，毒性相對(duì)較�。ㄐ∈�LD５０為９９．０mg·kg－１，sc），初步提示了鉤吻素子可能具有高效、低毒的抗焦慮作用。在此基礎(chǔ)上，本文采用大鼠高架十字迷宮為動(dòng)物模型，從不同角度進(jìn)一步探討鉤吻生物堿中鉤吻素子
的抗焦慮作用和特點(diǎn)。

文中結(jié)果提示，鉤吻素子在大鼠高架十字迷宮模型中呈現(xiàn)出與地西泮一致的抗焦慮作用，作用呈劑量依賴性。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)在大鼠高架十字迷宮單次給藥和連續(xù)給藥時(shí)，鉤吻素子的抗焦慮作用并不是呈經(jīng)典的線性關(guān)系。其原因可能是鉤吻素子在一定范圍內(nèi)達(dá)到了抗焦慮作用的最大效應(yīng)，其抗焦慮作用不再隨著藥物劑量的增加而增強(qiáng)，所以出現(xiàn)與焦慮相關(guān)的腦區(qū)對(duì)高劑量鉤吻素子反而不敏感。由此可見，在應(yīng)用鉤吻素子抗焦慮時(shí)要嚴(yán)格控制其劑量。此外，我們還觀察到鉤吻素子對(duì)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)活性并無顯著影響，說明其發(fā)揮抗焦慮作用的同時(shí)，無鎮(zhèn)靜催眠作用。
綜上所述，鉤吻素子可能有抗焦慮作用，并具有高效、低毒的特征，有望成為治療焦慮癥的新型藥物。鑒于焦慮動(dòng)物模型的多樣性，其抗焦慮作用還有待于在更多的模型上確證，其抗焦慮作用的機(jī)制也有待探究。