舌尖上的iTRAQ：蛋白質(zhì)組學(xué)研究選材四大原則

不想當(dāng)廚子的大夫不是個(gè)好科學(xué)家——尼古拉斯·黃黃

中國飲食文化博大精深，《舌尖上的中國》向世界展示了我們這個(gè)完美的吃貨民族。一道成功佳肴，食材挑選有著非常嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)。在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，實(shí)驗(yàn)與做菜亦有共通之處，做飯時(shí)如果偷懶，用煮過面條的湯煮餛飩，餛飩的賣相口感觀感都大為降低。實(shí)驗(yàn)也如此，一是一，二是二，必要精確審慎，更不可以偷懶，變通條件。偷工減料一時(shí)爽，數(shù)據(jù)糟糕難重復(fù)，山寨病毒雖省錢，博士延期哭成狗。

做菜最重要的便是原材料的品質(zhì)，放到嘴里之前，你永遠(yuǎn)不知道這道菜味道正不正，但新鮮優(yōu)質(zhì)的食材至少能提高這道菜的成功率，畢竟臭魚永遠(yuǎn)無法煲出鮮湯。蛋白質(zhì)組學(xué)研究亦如此，無污染無降解的合格樣本是找到靠譜差異蛋白的前提！本期黃博即向大家介紹定量蛋白質(zhì)組學(xué)高通量篩選技術(shù)中的一道硬菜——iTRAQ聯(lián)合串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)——的樣本選材。

iTRAQ 定量分析蛋白質(zhì)的基本原理是利用iTRAQ試劑是可與氨基酸末端氨基及賴氨酸側(cè)鏈氨基以共價(jià)鍵鏈接從而完成對(duì)肽段的標(biāo)記，經(jīng)過高效液相色譜分離，一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜分析，即可完成對(duì)樣本中蛋白質(zhì)的定性與相對(duì)定量。理論上講iTRAQ實(shí)驗(yàn)每個(gè)樣本需要的蛋白量至少300ug，然而實(shí)際上只要做過實(shí)驗(yàn)的人都能應(yīng)該都能理解所有實(shí)驗(yàn)的成功率并非100%，特別對(duì)于iTRAQ這種流程復(fù)雜、對(duì)儀器穩(wěn)定性依賴高的實(shí)驗(yàn)，因此保守起見，每次實(shí)驗(yàn)之前準(zhǔn)備的蛋白量最好滿足兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，此為其一。其二，是樣本準(zhǔn)備階段，單純從實(shí)驗(yàn)技術(shù)角度出發(fā)，只要能從樣本中提出蛋白即可進(jìn)行iTRAQ實(shí)驗(yàn)，但對(duì)于實(shí)驗(yàn)的目來說，我們收集的樣本是否真的符合要求？不一定！特別是對(duì)于臨床收集的樣本。

iTRAQ的優(yōu)點(diǎn)之一是樣本來源廣泛，幾乎所有收集的樣本都可利用該技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)組的篩選，不管是尋找功能蛋白質(zhì)、機(jī)制的探索，還是疾病Biomarker的篩選，一網(wǎng)打盡，盡快將樣本轉(zhuǎn)化成研究成果，避免這些珍貴的樣本在冰箱中睡大覺。

樣本形式多種多樣，組織、細(xì)胞、血液（血清或血漿）、腦脊液、尿液、骨關(guān)節(jié)滑液……不同樣本收集方法不盡相同，需要有針對(duì)性的protocol，總體來說，需滿足以下幾條：

代表性原則：取樣的代表性關(guān)系到實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否具有科學(xué)意義，因此您應(yīng)該根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康纳髦剡x擇您的取樣方案。實(shí)驗(yàn)與對(duì)照的樣本之間不能有污染，有條件時(shí)，應(yīng)做到實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的樣本在取材時(shí)間、部位、處理?xiàng)l件等方面盡可能保持一致，否則可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。體液樣本需要通過分步離心（或?yàn)V膜）去除其中細(xì)胞、細(xì)胞碎片及細(xì)菌等干擾因素。另外非常重要的一點(diǎn)是不同樣本來源的蛋白質(zhì)組是不一樣的，甚至同一組織中不同細(xì)胞之間的差異都會(huì)很大，這兩中樣本之間做定量是沒有可比性的，因此在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備樣本的時(shí)候一定要考慮生物實(shí)驗(yàn)中的單一變量原則。

準(zhǔn)確性原則：代表性樣本的各種特征數(shù)據(jù)必須被準(zhǔn)確記錄，并按要求（低溫、迅速）采集、制備、貯存、運(yùn)輸，最終正確地按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)處理。此外，詳細(xì)臨床數(shù)據(jù)（包括病理數(shù)據(jù)、預(yù)后隨訪數(shù)據(jù)等）的積累是保證數(shù)據(jù)分析結(jié)果的臨床意義的重要因素。

時(shí)效性原則：樣本質(zhì)量是各類檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵因素，因此用于研究的樣本，在采集、制備、貯存、運(yùn)輸過程中應(yīng)盡可能地做到迅速，最大限度的縮短從樣本采集到實(shí)驗(yàn)的時(shí)間。尤其要注意胰腺這類易降解樣本，以及尿液這類易受微生物污染的樣本。

低溫原則：樣本收集后，做好標(biāo)記與記錄，盡快液氮速凍，然后于-80℃冰箱中保存，干冰寄送，整個(gè)過程需避免樣本反復(fù)凍融，以防止蛋白質(zhì)的降解。但不要過于信賴-80°冰箱，即使冰箱的溫度波動(dòng)平穩(wěn)，保存其中的樣本仍然會(huì)發(fā)生緩慢降解，一般建議蛋白質(zhì)組學(xué)研究的樣本不要保存超過一年，長(zhǎng)時(shí)間保存的樣本需要經(jīng)過質(zhì)檢確定是否還能用。

為確保實(shí)驗(yàn)的順利，強(qiáng)烈建議在取樣時(shí)，應(yīng)同時(shí)備份，做一份，留一份，以防部分樣本降解，重新取材耽誤時(shí)間。即使樣本全部合格，備份的樣本還可以用來進(jìn)行其他方面的實(shí)驗(yàn)（如定量驗(yàn)證，蛋白方面，生化方面的實(shí)驗(yàn)等）。備份分為兩種，一種為嚴(yán)格備份，即：樣本取下后一分為二，這樣的兩份樣本基本上具備同性質(zhì)。另一種為非嚴(yán)格備份，即生物學(xué)重復(fù)的樣本，這樣的備份樣本同質(zhì)性要較前者差。

最后，針對(duì)于iTRAQ實(shí)驗(yàn)，不同的實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)，不同的樣本收集方法，黃博都備有相應(yīng)私貨，歡迎大家戳微信私聊。