ELISA常見問題及解決方案

 

抗體的非特異性結合

更換封閉液（例如，使用酪蛋白替代BSA）；封閉結束后不要清洗；倒出封閉液，吸水紙上吸干殘留液體后直接進行下一步。

未充分清洗酶標板

確保在清洗過程中每個微孔都充滿緩沖液、清洗儀器正常工作。各步驟之間清洗3~5次，不要增加清洗次數(shù)。清洗完成后，將酶標板用力按壓在紙巾上，以除去殘余的緩沖液。清洗溶液中應添加適量的Tween-20（推薦濃度0.01-0.1%）。

緩沖液被污染

緩沖液應新鮮配制，一周內使用，并過濾除菌。

孵育溫度太高

整個實驗過程應在室溫25℃。

孵育時間過長

縮短孵育時間

酶標記物污染了底物或者陽性對照污染了微孔

吸取不同的試劑時應更換吸頭，并使用不同的貯液器。最好用移液器加入或去除清洗緩沖液（倒入/倒出可能導致交叉污染）。

檢測抗體或Avidin-HRP的濃度過高

檢測濃度計算是否正確，或者進一步稀釋后再使用。

底物在使用前曝光

在將底物加入到微孔中以前，應始終避光保存

讀取吸光值時使用了錯誤的濾光片

ABTS為底物時應在405nm波長讀取吸光值（TMB為底物時應在450nm波長讀取吸光值），并以650nm作為校正波長。

顯色時間過長

每5分鐘讀取一次吸光值，以監(jiān)測空白孔的O.D.讀數(shù)。

 

遺漏了某種試劑或某個步驟

查看實驗方案，嚴格遵循實驗操作步驟。

清洗緩沖液中的去污劑濃度過高

去除或降低去污劑的濃度，推薦0.01-0.1%

酶標板未適當清洗

減少各步驟之間的清洗次數(shù)，尤其是當未使用全自動或半自動洗板機時，清洗1-2次即可。

樣本中存在酶抑制劑

疊氮鈉抑制了過氧化物酶的活性。

孵育時間或溫度錯誤

孵育期間應將酶標板放在孵育箱（25℃）內，以免出現(xiàn)溫度波動

加入微孔中的底物量有誤

檢查移液器

酶-底物系統(tǒng)不合適

Avidin-HRP和ABTS配對使用，Streptavidin和TMB配對使用

試劑盒內的組分儲存不當

按說明書要求儲存各組分

讀取吸光值時使用了錯誤的濾光片

ABTS為底物時應在405nm波長讀取吸光值（TMB為底物時應在450nm波長讀取吸光值），并以650nm作為校正波長

 

標準品配制有誤

使用推薦的稀釋緩沖液對標準品進行稀釋

過早稀釋

使用前再配制各種試劑，并盡快使用

捕獲抗體無法包被

使用適合做ELISA的板，不能用細胞培養(yǎng)板

清洗不充分

每個微孔中應加入等體積清洗液，確保所有微孔均可被抽吸干凈，并及時填充。

移液出錯

校正移液器，快速、等量的將移液器中的試劑沿微孔的側壁加入

顯色時間過長

空白孔的O.D.讀數(shù)不超過0.2或最高濃度標準品孔的O.D.讀數(shù)不超過1.2。

試劑盒內的組分儲存不當

按說明書要求儲存各組分，不要將重懸后的試劑在室溫放置時間過長。

 

試劑混合不充分

移液前，充分混合試劑

清洗不充分

每個微孔中應加入等體積清洗液，確保所有微孔均可被抽吸干凈，并及時填充。

移液出錯

校正移液器，快速、等量的將移液器中的試劑沿微孔的側壁加入

耗材重復使用

吸取不同樣本時應更換吸頭；不同的試劑使用不同的貯液器；個孵育時段內應用新的密封片封板。

微孔被吸頭或洗板機劃傷

吸液、加液時小心操作

樣本中存在沉淀物

使用前應離心樣本管

微孔不干凈或存在污垢

使用前仔細檢查微孔，并清除污垢。讀取吸光值前，請擦拭酶標板的底部，以去除污垢或指紋。

 

蒸發(fā)

每個孵育步驟都應使用密封片封板

溫度不均勻

孵育期間應將酶標板放在孵育箱（25℃）內，以免溫度波動，請勿堆疊酶標板。