ADC 單抗藥物的分子量、氨基酸序列、糖基化位點(diǎn)以及ADC 藥物結(jié)合位點(diǎn)鑒定

聶愛英

賽默飛世爾科技（中國）有限公司

 

Q-Exactive；ADC 單抗藥物；分子量測(cè)定；氨基酸序列分析；糖基化位點(diǎn)分析；ADC 藥物結(jié)合位點(diǎn)分析

 

單克隆抗體藥物是具有高度特異性的靶向藥物，能夠特異性作用于腫瘤細(xì)胞，被譽(yù)為治療惡性腫瘤的“生物導(dǎo)彈”。ADC 抗體藥，則是在抗體蛋白的特定天然氨基酸上非定點(diǎn)偶聯(lián)具有抗腫瘤作用的化療藥物（或稱小分子藥物），以增加單克隆抗體的療效、并降低小分子藥物的副反應(yīng)。對(duì)此，研究人士表示，這相當(dāng)于在“生物導(dǎo)彈”上精確地裝上了“核彈頭”，使得治療更加安全、有效、定向。目前，在整個(gè)腫瘤藥研究領(lǐng)域，ADC 抗體藥物已得到了業(yè)內(nèi)的普遍認(rèn)可。不少跨國藥企相繼投身到 ADC 藥物的研究開發(fā)中。為了保證 ADC 單抗藥物的安全性和有效性，以及對(duì)單抗藥物生產(chǎn)過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，對(duì)于 ADC 單抗藥物的整體分子量的測(cè)定、氨基酸序列的鑒定、糖基化位點(diǎn)的確認(rèn)、ADC 藥物結(jié)合位點(diǎn)的確認(rèn)、二硫鍵的定位、糖鏈結(jié)構(gòu)的解析等重要的 ADC 藥物分析指標(biāo)的測(cè)試和確認(rèn)，越來越受到各大制藥公司的關(guān)注。目前，隨著生物質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展和推廣，基于生物質(zhì)譜的單抗分析技術(shù)也開始全面、快速的建立起來。

 

Q-Exactive 串聯(lián)質(zhì)譜儀結(jié)合了高選擇性的四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)器和高分辨、高靈敏度的 Orbitrap^TM 質(zhì)量分析器，大大提高了離子的選擇性、靈敏度和質(zhì)量精度。該系統(tǒng)具有 140,000 的分辨率（FWHM）、更高的靈敏度、更快的掃描速度和更大的動(dòng)態(tài)范圍，同時(shí)結(jié)合了 HCD 碎裂技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)串級(jí)質(zhì)譜碎裂和鑒定，為深度復(fù)雜樣品分析，包括蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、脂類組學(xué)等樣品的鑒定，翻譯后修飾和定量分析，提供了全面、高效和快速的質(zhì)譜分析平臺(tái)。同樣，Q-Exactive 質(zhì)譜可以有效地應(yīng)用到 ADC 單抗藥物的研發(fā)和生產(chǎn)監(jiān)控中，基本的實(shí)驗(yàn)分析流程如下所示。

 

圖 1. 單抗分析基本流程圖

 

 

2.1.1 儀器和試劑

質(zhì)譜儀器：Q-Exactive（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜儀器：Accela 液相色譜系統(tǒng)（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜柱：Agilent Zorbax 300, SB-C8, 3 μm，2.1×50 mm ；

試劑：二次去離子水，色譜級(jí)乙腈，色譜級(jí)甲酸。

 

2.1.2 儀器方法

 

色譜分析條件：具體見表 1；

質(zhì)譜分析條件：具體見表 2；

 

表 1. 單抗分子量測(cè)定的色譜分析條件

流動(dòng)相	A：0.1% 甲酸水溶液；B：0.1% 甲酸乙腈溶液
流速	300 μL/min
柱溫	75℃
色譜梯度	時(shí)間/min	B相濃度/%
	0	5
	4	5
	12	90
	12.1	90
	16	90
	16.5	5
	20	5

 

表 2. 單抗分子量測(cè)定的質(zhì)譜分析條件

噴霧電壓	4 kV
毛細(xì)管加熱溫度	275℃
S-lens	60 %;
鞘氣流速	30（arb）
輔助氣流速	5（arb）
質(zhì)量掃描范圍	m/z 2000–4000
分辨率	17,500（m/z 200）
源內(nèi)裂解（SID）	100 eV
Microscan	10

 

 

2.2.1 儀器和試劑

質(zhì)譜儀器：Q-Exactive（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜儀器：Accela 液相色譜系統(tǒng)（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜柱：Thermo Scientific, C18, 100Å ,1.9 μm, 2.1×100 mm

試劑：二次去離子水，色譜級(jí)乙腈，色譜級(jí)甲酸。

 

2.2.2 儀器方法

色譜分析條件：具體見表 3；

 

表 3. 氨基酸序列測(cè)定的色譜分析條件

流動(dòng)相	A：0.1% 甲酸水溶液；B：0.1% 甲酸乙腈溶液
流速	300 μL/min
柱溫	35℃
色譜梯度	時(shí)間/min	B相濃度/%
	0	5
	4	5
	45	35
	50	90
	52	90
	52.5	5
	60	5

 

質(zhì)譜分析條件：具體見表 4；

 

表 4. 氨基酸序列測(cè)定的質(zhì)譜分析條件

噴霧電壓	3.5 kV
毛細(xì)管加熱溫度	275℃
S-lens	60 %;
碰撞能量	27% 歸一化能量
碎裂方式	HCD
質(zhì)量掃描范圍	m/z 300–1800
分辨率	一級(jí)35,000（m/z 200）,
	二級(jí)17,500（m/z 200）

 

2.2.3 數(shù)據(jù)分析方法

采用 Proteome Discoverer 1.3 軟件對(duì)原始譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索，具體搜庫參數(shù)為：包含單抗氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫；半胱氨酸（C）烷基化（+57.021Da）設(shè)置為固定修飾；甲硫氨酸（M）氧化（+15.995Da）、天冬酰胺（N）和谷氨酰胺（Q）脫氨基化（+0.984Da）、賴氨酸（K）ADC結(jié)合（+956.3644Da）、天冬酰胺（N）G0F糖基化（+1444.5300Da）設(shè)置為可變修飾；trypsin 設(shè)置為酶；酶漏切位點(diǎn)為 2。

 

 

基于高分辨質(zhì)譜 Q-Exactive，為了保證采集譜圖的質(zhì)量和數(shù)量，我們?cè)O(shè)定 Orbitrap 檢測(cè)器的采集分辨率為 17,500。經(jīng)過 Q-Exactive 質(zhì)譜采集的 ADC 單抗藥物的原始色譜質(zhì)譜總離子流圖和原始質(zhì)譜圖如圖 2 和 3 所示，我們可以觀察到 ADC 抗體藥物在整個(gè)質(zhì)量范圍內(nèi)表現(xiàn)出均勻的電荷分布，不同電荷的質(zhì)譜峰之間可以實(shí)現(xiàn)基線分離，從而可以判斷質(zhì)譜的靈敏度、分辨率和信噪比都很高。同時(shí)選取強(qiáng)度較高的幾組質(zhì)譜峰進(jìn)行放大，放大之后的幾組質(zhì)譜峰顯示相似的分布模式。

 

圖 2. ADC 抗體藥物色譜質(zhì)譜流出圖

 

 

圖 3. ADC 抗體藥物原始質(zhì)譜圖（紅色虛線框內(nèi)為中間幾組峰的放大圖）

 

經(jīng)過 Protein Deconvolution 2.0 軟件去卷積處理之后的單抗分子量分布圖如下所示（圖 4），根據(jù)單抗的氨基酸理論序列分子量進(jìn)行計(jì)算，將觀察到的質(zhì)譜峰進(jìn)行歸屬，從圖中我們觀察到，該 ADC 單抗分子之間存在 956 Da 左右的質(zhì)量增加，由此推斷該單抗分子結(jié)合了不同數(shù)目的分子量在 956 Da 左右的藥物小分子，并且最多可以檢測(cè)到 6 個(gè)藥物小分子的結(jié)合。同時(shí)還觀察到 160 Da 左右的質(zhì)量增加，這主要是由于連接基團(tuán)的存在引起的。從而初步推斷該 ADC 單抗藥物主要結(jié)合了 6 個(gè) ADC 小分子藥物，該結(jié)果與理論值基本一致，同時(shí)根據(jù)質(zhì)譜峰的峰強(qiáng)度信息，我們還可以計(jì)算得到該藥物的 ADR 值，該數(shù)值對(duì)于 ADC 藥物的有效性評(píng)估至關(guān)重要。

 

 

圖 4. Q-Exactive 質(zhì)譜采集的 ADC 單抗原始質(zhì)譜圖經(jīng)過 Protein

Deconvolution 2.0 軟件去卷積處理之后的單抗分子量分布圖

（D0–D6 表示不同 ADC 藥物小分子結(jié)合的單抗變體，藍(lán)色圓圈表示連接基團(tuán)對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜峰。）

 

3.2.1 氨基酸序列覆蓋

通過 trypsin 酶解后的肽段，在 Q-Exactive 質(zhì)譜上采集到的色譜質(zhì)譜流出圖如圖 5 所示，再經(jīng)過 SEQUEST 數(shù)據(jù)庫搜索后，ADC 單抗重鏈的蛋白序列覆蓋度為 90.24 %，如圖 6（A）所示，輕鏈的蛋白序列覆蓋度為 100 %，如圖 6（B）所示，其中未鑒定到的氨基酸序列主要是由于缺乏酶切位點(diǎn)和酶切后肽段較短造成的，為了實(shí)現(xiàn) 100% 的氨基酸序列覆蓋，可以通過選擇其它內(nèi)切蛋白酶來實(shí)現(xiàn)。

 

 

圖 5. ADC 單抗藥物的 Trypsin 酶解肽段的色譜質(zhì)譜流出圖

 

 

圖6. ADC 抗體藥物經(jīng)過 trypsin 酶解和 Q-Exactive 質(zhì)譜實(shí)現(xiàn)的氨基酸序列覆蓋度示意圖。（A 為重鏈氨基酸序列覆蓋示意圖，B 為輕鏈氨基酸序列覆蓋示意圖，其中綠色標(biāo)記的氨基酸序列表示該段序列鑒定的可靠性非常高，達(dá)到 99% 以上，紅色標(biāo)記的氨基酸序列表示該段序列鑒定的可靠性為 95% 以下，無顏色標(biāo)記的氨基酸序列表示該段序列沒有被鑒定到，氨基酸序列上方的數(shù)字代表氨基酸的位置。）

 

ADC 單抗蛋白與其他單抗蛋白相同，也都包含 N-糖基化修飾，一般發(fā)生在保守序列 NXS 或 NXT 中（X 為除脯氨酸外的任意氨基酸）。在糖鏈完整的情況下，直接進(jìn)行 trypsin 酶解，我們?cè)谒褞鞎r(shí)進(jìn)行 G0F 糖基化可變修飾設(shè)定，可以直接獲得該 N 糖基化位點(diǎn)：重鏈氨基酸序列 EEQY N261STYR 中的 N261 位點(diǎn)，下圖為該肽段的 G0F 串級(jí)質(zhì)譜圖，除了圖中黃色和藍(lán)色代表的該肽段的 b、y 碎片離子外，紅色圓圈所示的為該糖肽的糖特征碎片離子（低 m/z 端）和糖肽碎片離子（高 m/z 端），從而可以準(zhǔn)確確證該糖肽和糖基化位點(diǎn)的存在。

 

圖 7. 重鏈氨基酸序列 EEQYN261STYR 的串級(jí)質(zhì)譜圖

 

根據(jù) Proteome Discovery 軟件搜庫結(jié)果顯示，我們發(fā)現(xiàn)在賴氨酸結(jié)合藥物分子的肽段的串級(jí)質(zhì)譜圖中存在特征碎片離子 453.20、485.23 和 547.21，因此我們通過這些特征碎片對(duì)所有的可能發(fā)生 ADC 結(jié)合的肽段的串級(jí)質(zhì)譜圖進(jìn)行人工確認(rèn)，最終準(zhǔn)確確認(rèn)了輕鏈中 2 個(gè)賴氨酸位點(diǎn)和重鏈中 7 個(gè)賴氨酸位點(diǎn)發(fā)生了 ADC 小分子藥物結(jié)合，具體位點(diǎn)如下圖（圖 8）所示，并且以其中一條肽段為例，給出了 ADC 結(jié)合肽段的串級(jí)質(zhì)譜圖（圖 9），紅色圈表示 ADC 特征碎片離子。同時(shí)我們也觀察到 ADC 藥物結(jié)合后的肽段的疏水性比較強(qiáng)，色譜流出比較靠后，這一現(xiàn)象完全符合理論推測(cè)。

 

圖 8. ADC 藥物小分子結(jié)合位點(diǎn)示意圖

 

 

圖 9. ADC 結(jié)合肽段 VSNKALPAPIEK 的串級(jí)質(zhì)譜圖

 

本文通過 Q-Exactive 質(zhì)譜建立了 ADC 單抗藥物的整體分子量測(cè)定、氨基酸序列鑒定、糖基化位點(diǎn)和 ADC 藥物結(jié)合位點(diǎn)確認(rèn)的分析方法，為 ADC 單抗藥物研發(fā)分析和實(shí)時(shí)生產(chǎn)檢測(cè)提供了高效、快速的分析平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 Q-Exactive 串聯(lián)質(zhì)譜儀，憑借其超高的分辨率，超快的掃描速度，超高的質(zhì)量精度、超低的靈敏度和超大的動(dòng)態(tài)范圍，極大地完善和推動(dòng)了 ADC 單抗藥物的鑒定分析。

 

 

     Orbitrap組學(xué)俱樂部                  賽默飛小分子質(zhì)譜應(yīng)用技術(shù)群