線性離子阱多種解離技術對阿德福韋酯雜質譜的全面鑒定

活性藥物成分（API）和成品藥的雜質分析是藥物研發(fā)中不可或缺的一環(huán)。雜質的化學結構信息在評估毒性、改進合成途徑，以及根據目標成藥選擇最佳劑型至關重要。

 

為保證藥效與消費者的安全，世界各國的監(jiān)管機構都制定了藥物雜質分析的指引，清楚說明基于日服用量、使用時間，和藥物靶標的限量標準。

 

LCMS 已經成為最常用的未知雜質分析技術。為了能在大量母藥中識別并表征痕量雜質，具有高靈敏度、高掃描速度，并且能進行多級質譜分析（MSn） 的質譜儀必不可少。

 

在本研究中，Sigma-Aldrich 所售的研究級阿德福韋酯（adefovir dipivoxil，ADP） 被用來作為模型化合物進行API 雜質分析。ADP 是廣泛用于慢性乙肝病毒感染的一種抗病毒處方藥。本研究中使用的LCMS 系統(tǒng)由Thermo Scientific AccelaTM UHPLC 以及 Velos ProTM 線性離子阱質譜儀構成。碎片信息通過結合應用 CID 與Trap-HCD 解離技術獲得。數(shù)據處理通過軟件Mass FrontierTM 完成。

 

 

材料與試劑

阿德福韋酯（Adefovir dipivoxil，CAS# 142340-99-6）從Sigma-Aldrich 購得，產品號A9730。

乙腈和水 （Fisher）；乙酸銨（Sigma-Aldrich，產品號73594-25G-F）；甲酸（Sigma-Aldrich，產品號33015-500ml）。

 

ADP 溶液，0.5mg/mL，用1 ml 20 : 80 的乙腈和水混合溶劑溶解0.5mg ADP 獲得。

 

HPLC 系統(tǒng)：Thermo Accela 1250 泵，開放式Accela 自動進樣器及Accela PDA

色譜柱： Hypersil GOLD C18 2.1×150 mm，3 μM，

Thermo Scientific 產品號 071399

柱溫：35 ℃

流速：0.5 ml/ 分鐘

進樣體積：8 μl

流動相：A – 水，B – 乙腈，C - 100 mM 乙酸銨，用乙酸調至pH 5

梯度洗脫：

 

 

質譜儀：配有 HESI-II 離子源的Velos ProTM 線性離子阱離子化條件：電噴霧， 正離子模式

1. 全掃模式 m/z 120-1000 amu/ Top5 dd MS/MS，HCD NCE 35%

2. 全掃模式/ 按母離子列表dd MS2/ TOP 3 ddMS3,CID/ Trap-HCD NCE 20%

a. CID MS² / CID MS³

b. CID MS² / HCD MS³

c. HCD MS² / CID MS³

d. HCD MS² / HCD MS³

 

 

 

ADP 雜質譜分析流程由兩次連續(xù)的LCMS實驗構成。分析目標是為雜質鑒定和結構解析收集盡可能多的信息。第一個 MS 實驗包括全掃描和后續(xù)的 Top5 HCD 數(shù)據依賴MS/MS 掃描（圖1）。 接下來，數(shù)據通過MassFrontier 當中的Fragment Ion Search（碎片離子檢索，F(xiàn)ISh）算法進行處理，這是一個新穎的進行雜質檢出及鑒定的方法，主要基于母離子解離模式的比較（圖2a，b）。與母藥擁有相同碎片的成分會被“FISh”識別出來，見圖3。

 

 

圖1.阿德福韋酯的質譜總離子流圖

 

 

圖2. 用Mass Frontier“FISh”算法檢測出雜質成分

 

標注：FISh 檢測到的成分

 

 

圖3. “FISh”算法檢測出的雜質成分的XIC

 

進一步的結構信息通過結合母化合物列表、使用Trap-HCD 和CID 解離組合進行MS² 實驗獲得。

 

當歸一化的碰撞能量水平相同時，Trap-HCD 比 CID 生成的碎片譜圖信息更豐富。Trap-HCD 沒有低質量數(shù)歧視效應，見圖4。CID MSn 能夠提供步進的裂解信息，對結構解析非常有價值，見圖5，6。

 

 

圖4. 阿德福韋酯在相同的 25%NCE水平下的CID & HCD MS² 譜圖

 

- 全掃，CID dd MS²（設定母離子列表），然后對前三的MS²碎片離子進行 HCD MS³

- 全掃, CID dd MS² （設定母離子列表），然后對前三的MS²碎片離子進行 CID MS³

- 全掃, HCD dd MS² （設定母離子列表），然后對前三的MS²碎片離子進行 CID MS³

- 全掃, HCD dd MS² （設定母離子列表），然后對前三的MS²碎片離子進行 HCD MS³

 

 

圖5. 雜質m/z 558.19的CID與HCD譜圖比對

 

 

圖6. 雜質 m/z 388.13的CID和HCD MS² , MS³譜圖

 

 

圖 7. Sigma-Aldrich所售研究級阿德福韋酯（adefovir dipivoxil）樣品中所含雜質的可能結構式

 

根據豐富的HCD、CID  MS²和  MS³ 碎片信息（見圖7），對鑒定出的雜質化合物進行了結構預測。每個雜質組分的精確質量數(shù)和元素組成通過臺式Orbitrap Q ExactiveTM 質譜儀的高分辨數(shù)據確認。

 

表1. 雜質組分的精確質量數(shù)和元素組成通過Q Exactive 高分辨數(shù)據確認

 

 

 

兩種解離技術—Trap-HCD 和CID—被用來表征市售研究級阿德福韋酯（adefovir dipivoxil）樣品中的十三種低含量雜質。當歸一化的碰撞能量水平相同時，Trap-HCD 比CID 生成的碎片譜圖信息更豐富。Trap-HCD 不存在低質量歧視效應。另一方面，CID 能夠提供逐級裂解信息和MSⁿ 譜圖，對于闡明子結構關聯(lián)非常有價值。本研究的結果證明，結合數(shù)據后處理軟件使用這兩種互補的解離方式能夠出色完成雜質鑒定與結構解析，提高了未知雜質分析的速度與可靠性。

 

藥物雜質分析解決方案--離子阱多級液質