銳博生物：外泌體miRNA研究案例：腫瘤細(xì)胞分泌的exo通過(guò)其包含的miR-21促進(jìn)轉(zhuǎn)移前表型

銳博生物：教科書(shū)般的外泌體miRNA研究案例

近日，四川腫瘤醫(yī)院的朱桂全老師在Cancer Research發(fā)表了一篇研究外泌體miRNA與癌癥的文章。小編認(rèn)為該研究的思路對(duì)廣大外泌體研究者具有很好的參考作用，所以今天給大家?guī)��?lái)這篇文章的詳細(xì)解讀。

1、首先，提取exo

方法：分別從缺氧 (1%O₂) 或正常 (20%O₂) 培養(yǎng)的OSCC(口腔鱗狀細(xì)胞癌)細(xì)胞培養(yǎng)基上清提取exo (外泌體)，掃描電鏡觀察形態(tài)，Western blot檢測(cè)exo marker CD63和CD81

掃描電鏡觀察顯示提取產(chǎn)物直徑為50～200nm。

2、缺氧腫瘤細(xì)胞分泌的exo能影響正常腫瘤細(xì)胞嗎？

方法：給缺氧exo (缺氧培養(yǎng)的細(xì)胞分泌的exo) 添加熒光PKH67標(biāo)簽，孵育OSCC細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察

共聚焦顯微鏡顯示PKH67標(biāo)記的exo(綠色)被OSCC細(xì)胞內(nèi)化吸收。

3、缺氧exo對(duì)正常OSCC細(xì)胞遷移和入侵有何作用？

方法：敲降細(xì)胞的HIF-1α或HIF-2α，提取exo后孵育細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

缺氧exo增強(qiáng)細(xì)胞遷移和入侵，但敲降后exo不能。

4、為什么缺氧exo有此功能？或許是exosomal miRNA起的作用

方法：OSCC細(xì)胞株Cal-27正常或缺氧培養(yǎng)24h，從細(xì)胞培養(yǎng)基提取exo，提取總RNA，進(jìn)行miRNA測(cè)序 (exo提取、測(cè)序、生物信息分析工作由銳博生物完成)

reads中非編碼RNA的量。Normoxia，氧正常；Hypoxia，缺氧
 

Venn圖(文氏圖)顯示兩組exo的unqiue和ovelapping miRNA
 

heatmap(熱圖)顯示兩組exo中差異表達(dá)的miRNA。紅色，高豐度表達(dá)；綠色，低表達(dá)；黑色，中間值。基因表達(dá)數(shù)據(jù)通過(guò)Illumina HiSeq2500平臺(tái)二代測(cè)序(銳博生物提供)獲得

qRT-PCR驗(yàn)證缺氧exo中表達(dá)量增強(qiáng)的三條miRNA

5、通過(guò)測(cè)序得到了差異表達(dá)miRNA，下一步做什么？

研究者從3條miRNA中選擇了差異顯著且表達(dá)最高的miR-21作為接下來(lái)的研究對(duì)象，研究它與HIF-1α、HIF-2α的關(guān)系。
 

敲降HIF-1α、HIF-2α，檢測(cè)細(xì)胞、exo中miR-21水平；ChIP實(shí)驗(yàn)看相互作用

缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞、exo表達(dá)miR-21，是通過(guò)HIF-1α、HIF-2α與miR-21 HRE區(qū)結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。

再研究miR-21對(duì)細(xì)胞遷移與入侵的作用。

 

方法：敲降缺氧或正常細(xì)胞的miR-21，提取exo后孵育細(xì)胞，進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)；敲降HIF-1α、HIF-2α后再過(guò)表達(dá)miR-21，即挽救實(shí)驗(yàn)

miR-21是缺氧exo誘導(dǎo)細(xì)胞遷移、入侵所依賴的。

挽救實(shí)驗(yàn)。C：腫瘤細(xì)胞刮痕實(shí)驗(yàn)。白線：0h成像；藍(lán)線：24h成像。D：exo處理OSCC細(xì)胞后進(jìn)行侵入實(shí)驗(yàn)

6、細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)做完整了，接下來(lái)開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

方法：將Cal-27細(xì)胞皮下注射到nu/nu小鼠，生成60 mm³腫瘤。注射缺氧或正常exo (10ug) 到移植瘤中央，檢測(cè)各種指標(biāo)

腫瘤exo的miR-21誘導(dǎo)移植瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

7、臨床樣本分析

從OSCC病人血清提取exo (OSCC exo)，檢測(cè)miR-21水平。

OSCC exo中miR-21水平更高，此水平與T stage 、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及HIF-1α表達(dá)相關(guān)。

8、總結(jié)

本研究發(fā)現(xiàn)缺氧exo孵育細(xì)胞后有特殊的表型，對(duì)缺氧和正常exo進(jìn)行miRNA測(cè)序，獲得了差異表達(dá)的miRNA；接著敲降miRNA及其相關(guān)的基因，提取exo后孵育細(xì)胞，回到細(xì)胞中研究exo、miRNA的功能；最后動(dòng)物腫瘤模型與臨床數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證明了低氧微環(huán)境下腫瘤細(xì)胞分泌的exo通過(guò)其包含的miR-21促進(jìn)轉(zhuǎn)移前行為。

缺氧腫瘤exo可以轉(zhuǎn)移到氧正常區(qū)域、使非缺氧細(xì)胞轉(zhuǎn)化為轉(zhuǎn)移前表型

原文：Li L, et al. Exosomes Derived from Hypoxic Oral Squamous Cell Carcinoma Cells Deliver miR-21 to Normoxic Cells to Elicit a Prometastatic Phenotype. Cancer Res. 2016 Mar 18.

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