蛋白-蛋白相互作用技術(shù)內(nèi)容

技術(shù)內(nèi)容

    蛋白質(zhì)并非孤立存在的生物分子，而是具有特定三維空間結(jié)構(gòu)并與其他蛋白質(zhì)相互作用，共同執(zhí)行功能。因此，蛋白質(zhì)的模塊及空間組織與其表達(dá)水平具有同樣的重要性。為了解析蛋白質(zhì)組的組織結(jié)構(gòu)單元而開(kāi)發(fā)的基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)方法通常結(jié)合了質(zhì)譜檢測(cè)與各種生化試驗(yàn)。其中最經(jīng)典的技術(shù)為1999^[1]首次報(bào)導(dǎo)的親和純化－質(zhì)譜技術(shù)（affinity purification – mass spectrametry，AP-MS）。既可進(jìn)行大規(guī)模的protein interactome 構(gòu)建^[2]，也能針對(duì)特定條件下特定蛋白質(zhì)的互作進(jìn)行差異分析、時(shí)間動(dòng)態(tài)分析等^[3]。

圖１：AP-MS技術(shù)的兩種運(yùn)用。

技術(shù)原理
    使用親和標(biāo)簽 (AP-MS) 或特異性抗體 (CoIP-MS)，在native條件下純化與目標(biāo)蛋白質(zhì)相互作用的蛋白，進(jìn)而使用質(zhì)譜進(jìn)行鑒定，通過(guò)test\control比對(duì)，過(guò)濾非特異結(jié)合蛋白，定性定量分析與特定蛋白質(zhì)直接或間接作用的蛋白質(zhì)。同時(shí)，結(jié)合 LFQ/TMT等定量技術(shù)，可以方便的研究特定蛋白互作關(guān)系隨時(shí)間的變化情況。

圖２：ＡＰ－ＭＳ技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理。

樣品要求

案例展示
    1、哈佛大學(xué)Steven P. Gygi教授實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用高通量AP-MS技術(shù)，進(jìn)行了２594組AP-MS實(shí)驗(yàn)，鑒定了23744個(gè)相互作用，包括了7668個(gè)蛋白質(zhì)，為研究蛋白尤其是功能未知蛋白提供了重要參考意義^[2] 。

圖３：高通量AP-MS技術(shù)．

2、為了更好的了解生物學(xué)過(guò)程的內(nèi)在動(dòng)態(tài)變化情況，蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院的Ruedi Aebersold教授實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用AP-MS技術(shù)研究了14-3-3b scaffold protein 的蛋白互作組在IGF1刺激下，insulin-PI3K-AKT信號(hào)通路隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程^[3] 。

圖４：運(yùn)用AP-MS研究14-3-3 scaffold protein 互作蛋白的時(shí)間動(dòng)態(tài)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)５種不同的cluster模式，對(duì)研究該信號(hào)通路的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程具有重大指導(dǎo)意義。

參考文獻(xiàn)
1. Rigaut, G.; Shevchenko, A.; Rutz, B.; Wilm, M.; Mann, M.; Seraphin, B., A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature biotechnology 1999, 17 (10), 1030-2.
2. Huttlin, E. L.; Ting, L.; Bruckner, R. J.; Gebreab, F.; Gygi, M. P.; Szpyt, J.; Tam, S.; Zarraga, G.; Colby, G.; Baltier, K.; Dong, R.; Guarani, V.; Vaites, L. P.; Ordureau, A.; Rad, R.; Erickson, B. K.; Wuhr, M.; Chick, J.; Zhai, B.; Kolippakkam, D.; Mintseris, J.; Obar, R. A.; Harris, T.; Artavanis-Tsakonas, S.; Sowa, M. E.; De Camilli, P.; Paulo, J. A.; Harper, J. W.; Gygi, S. P., The BioPlex Network: A Systematic Exploration of the Human Interactome. Cell 2015, 162 (2), 425-40.
3. Collins, B. C.; Gillet, L. C.; Rosenberger, G.; Rost, H. L.; Vichalkovski, A.; Gstaiger, M.; Aebersold, R., Quantifying protein interaction dynamics by SWATH mass spectrometry: application to the 14-3-3 system. Nat Meth 2013, 10 (12), 1246-1253.