應用原代細胞進行高通量復雜炎癥分析
前言
炎癥反應的一個重要步驟是細胞表面抗原與血管中免疫細胞的特異性結合。因此，對這些分子變化的及時監(jiān)控，如VCAM,E-selectin，以及內皮細胞上的HLADR等等，可以為細胞水平的炎癥模型提供有效的生理指標上的支持。
我們用多通道熒光讀取人原代細胞表面的炎癥標記，并在此基礎上評估不同介質對炎癥反應的調節(jié)作用。例如，在用炎癥因子(TNF或者IFN)刺激原代內皮細胞(HUVEC)后，細胞表面的炎癥標記表達可以通過檢測與之結合的預染抗體的總熒光強度來定量。
我們在多個指標如增加組間差異，重復性和通量上對IsoCyte掃描細胞計數(shù)儀和SpectraMax®M5微孔板讀板機進行了比較。多通路的讀值在檢驗抗炎化合物的有效性和毒性的同時，還可以通過選擇性抑制不同信號通路激活的炎癥標記來深入的研究相關機制。
炎癥實驗
用炎癥因子（TNF, IFN；R&D）刺激HUVEC細胞（lonza）24h。用BD 公司說明書推薦的方法，利用預染抗體和粘附分子的特異性結合對細胞進行染色標記。
選擇的抗體包括：
PE-conjugated anti-CD106 (VCAM),
APC conjugated anti E selectin
APC-conjugated anti-HLA-DR
AF488-conjugated anti-CD31（PECAM）
方法
熒光檢測炎癥標記
演示中的IsoCyte-DL 掃描細胞計數(shù)儀 平臺配置了20mW 488nm和40mW 640nm的激光器。488nm的激光器配套510-540nm的帶通(bp)濾光片(Ch1)可用于檢測Alexa Fluor®488(AF488)標記的細胞；Phycoerythrin標記細胞的檢測則需要配560-610nm bp的濾光片(Ch3)；APC的檢測需要640nm的激發(fā)和660-720nm的發(fā)射濾光片。圖像的獲取是通過5*5的微米采樣，在5min內對96孔或者384孔板完成掃描。
SpectraMax® M5 多孔板讀板機包含的488nm激發(fā)和530nm散射(二向色鏡 515nm)可以檢測Alexa Fluor®488標記的細胞，590nm(二向色鏡550nm)可以檢測Phycoerythrin標記細胞。
結果和討論
用SpectraMax® M5 檢測炎癥標記的表達
抗炎化合物抑制黏附分子
潛在抗炎化合物比較
多通路炎癥實驗
高通量實驗評估抗炎化合物效力
總結
- 我們通過檢測標記抗體與粘附分子的結合，可以有效的評估抗炎化合物的效能。
- 我們已經(jīng)測試了多種炎癥因子和抗炎藥物組合對HUVEC細胞的不同處理條件下，細胞炎癥標記，如VCAM,E-selectin，HLA-DR,CD31的表達水平。
- 運用多通道的IsoCyte 或 SpectraMax® M5可以有效監(jiān)測炎癥標記的上調和下調。
- 我們的數(shù)據(jù)包括利用3種已知的抗炎化合物：AG126，SB202190和PDTC來評估抗炎分子的效力。
- 在高通量兼容模式下，我們可以在96孔和384孔板水平上用多通路炎癥實驗檢驗抗炎化合物的效力。
