細(xì)胞污染過(guò)程中常見(jiàn)的微生物污染和預(yù)防

導(dǎo)語(yǔ)

你正在細(xì)胞科學(xué)的海洋愉快遨游，如果有一天，細(xì)胞污染忽然跑過(guò)來(lái)說(shuō)：“大家好，我是細(xì)胞污染~”這時(shí)候，科研的小船說(shuō)翻就翻。

今天Esco就同大家淺談細(xì)胞污染，拋磚引玉。

體外細(xì)胞污染分類: 物理性、化學(xué)性、生物性污染。其中生物性污染常見(jiàn)且造成的后果也較為嚴(yán)重，培養(yǎng)的細(xì)胞一旦遭到微生物污染，將具有不可逆轉(zhuǎn)性。輕則污染細(xì)胞廢棄，重則連帶污染培養(yǎng)箱內(nèi)的其他細(xì)胞，甚至整個(gè)實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境，給科研工作帶來(lái)嚴(yán)重的損失和威脅。

一、怎樣判斷你的細(xì)胞是何種生物性污染？

1.細(xì)菌污染

常見(jiàn)細(xì)菌種類為大腸桿菌、枯草桿菌、假單胞菌等(革蘭陰性菌)、 葡萄球菌等(革蘭陽(yáng)性菌)，其中革蘭陽(yáng)性菌較為多見(jiàn)。

主要來(lái)源：操作不當(dāng)或是器材消毒不嚴(yán)，或是各種營(yíng)養(yǎng)成分隱性污染細(xì)菌沒(méi)有被檢測(cè)出來(lái)所造成的。

特點(diǎn)：污染速度快，易被發(fā)現(xiàn)。多數(shù)情況下細(xì)胞培養(yǎng)液短時(shí)間內(nèi)變黃，培養(yǎng)基1～2d就會(huì)變渾濁，pH值降低，倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)胞漿出現(xiàn)大量顆粒，細(xì)胞變圓或崩潰，從壁上脫落，培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮，呈細(xì)沙狀，污染較輕時(shí)可見(jiàn)小菌體在細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)。

圖1 細(xì)菌污染

圖2 洋蔥佰克霍爾德菌污染

2.真菌污染

污染培養(yǎng)細(xì)胞的多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。

主要來(lái)源：實(shí)驗(yàn)人員（實(shí)驗(yàn)服）

特點(diǎn)：短期內(nèi)不會(huì)引起培養(yǎng)液的渾濁，可在培養(yǎng)液中形成白色或黃色漂浮物，一般肉眼可見(jiàn)，較易被發(fā)現(xiàn)，4d左右才可在高倍鏡下觀察到絲狀、管狀或樹(shù)枝狀菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有些真菌開(kāi)始很像死細(xì)胞碎片，只是它很多很多的小塊很清楚，象珊瑚狀，不象細(xì)胞碎片分不清，慢慢的會(huì)長(zhǎng)出很細(xì)的黑色絲狀物。

圖3 真菌污染

圖4 霉菌（絲霉）污染 培養(yǎng)基呈淡紫色，或不變色，但會(huì)變得粘稠，并且具有季節(jié)性，長(zhǎng)蘑菇的季節(jié)很容易污染這種菌類。

念珠菌污染呈鏈狀排列，呈卵圓形散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間。

圖5 白色念珠菌污染 常見(jiàn)的細(xì)胞污染之一，左側(cè)為倒置顯微鏡下視圖，右側(cè)為革蘭氏染色圖片，其中，長(zhǎng)梭型的是處于分裂期的鏈珠菌

酵母污染很容易觀察到，培養(yǎng)物變渾濁，尤其在后期。一般pH值變化很小，嚴(yán)重時(shí)，pH值升高。顯微鏡下呈卵圓形或球形顆粒，有些會(huì)芽生較小顆粒。

圖6 酵母菌污染

3.支原體污染

支原體是一類無(wú)細(xì)胞壁、大小介于細(xì)菌和病毒之間（直徑在0.13～0.18 μm）并獨(dú)立生活的微生物，可穿過(guò)0.22 μm 的孔徑濾膜！光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)！并對(duì)青霉素有抗藥性！簡(jiǎn)直就是細(xì)胞培養(yǎng)界的隱性殺手有木有！

主要來(lái)源：血清

特點(diǎn)：支原體污染不能用肉眼或光學(xué)顯微鏡檢查細(xì)胞觀察出來(lái)，帶有一定的隱蔽性，易被人們忽視。當(dāng)細(xì)胞被支原體污染后，在光鏡下�？梢�(jiàn)到細(xì)胞核及胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的顆粒或空泡，細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液可能毫無(wú)變化，短期內(nèi)細(xì)胞沒(méi)有明顯的病理變化，也可以因?yàn)閭鞔�或換液而緩解。只有當(dāng)污染嚴(yán)重時(shí)才影響細(xì)胞增殖，使細(xì)胞脫落。支原體可以與宿主細(xì)胞形成一個(gè)共生關(guān)系，使污染不斷擴(kuò)大。一旦發(fā)生支原體污染，支原體可以通過(guò)移液、傾倒液體時(shí)產(chǎn)生具有潛在感染力的飛沫和吸附的塵埃，沉積在物體表面。這種污染性塵埃能存活數(shù)天甚至數(shù)周，使操作環(huán)境受到污染，若不及時(shí)處理還會(huì)產(chǎn)生交叉污染或再次污染。

檢測(cè)：常用的檢查方法為培養(yǎng)檢測(cè)法，即取1mL細(xì)胞培養(yǎng)液加入支原體液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5天后，觀察培養(yǎng)基的顏色變化。如果變黃則懷疑該細(xì)胞受到支原體污染。如果不變色，則盲傳一代。若顏色變黃，可接支原體固體培養(yǎng)基，于5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5天，觀察有無(wú)“煎蛋”狀支原體菌落。一旦發(fā)生污染即淘汰該細(xì)胞和培養(yǎng)液。

圖7 支原體污染 煎蛋狀和其他形狀，左側(cè)：電鏡照片(×30k)； 右側(cè)：電鏡照片（×12k）

此外，支原體污染還可用熒光染色法和相差顯微鏡觀察法等檢測(cè)方法,或者直接購(gòu)買支原體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

4.黑膠蟲(chóng)污染

黑蛟蟲(chóng)是一種生物還是非生物，學(xué)術(shù)界還有爭(zhēng)論。可以穿透濾膜，也可以通過(guò)空氣傳播。

主要來(lái)源：血清

特點(diǎn)：開(kāi)始污染時(shí)對(duì)細(xì)胞無(wú)影響，當(dāng)數(shù)量達(dá)到一定程度時(shí)就會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響。400倍顯微鏡下可見(jiàn)點(diǎn)狀或片狀游動(dòng)小體。，培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會(huì)太影響，細(xì)胞還是可以用的。常常是細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，且觀測(cè)到的運(yùn)動(dòng)物無(wú)明顯增多，且培養(yǎng)液顏色、透明度無(wú)明顯變化，可在同一批號(hào)的血清養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不會(huì)有明顯影響，在細(xì)胞增殖旺盛之后會(huì)自然消失，除更換血清外無(wú)須特殊處理。

5.病毒污染

盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。因此，潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。

主要來(lái)源：動(dòng)物血清或者細(xì)胞系，常見(jiàn)于雜交瘤細(xì)胞。

特點(diǎn)：極為隱蔽，很難用常規(guī)的方法檢測(cè)到。受病毒污染的細(xì)胞液通常清亮無(wú)變化，大多數(shù)受病毒污染的細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生形態(tài)變化及細(xì)胞病理現(xiàn)象，少部分病毒會(huì)造成細(xì)胞變圓、腫脹，脫落。

檢測(cè)：可用血細(xì)胞吸附試驗(yàn)、免疫熒光抗體法及電子顯微鏡法有效檢出病毒。通常病毒物污染的清除是十分困難的，可以重新引入高質(zhì)量的細(xì)胞株。

6.非同種細(xì)胞污染

即細(xì)胞交叉污染，一般來(lái)自細(xì)胞建株和細(xì)胞傳代過(guò)程中兩種或兩種以上細(xì)胞之間的混合污染。一種是由于細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒(méi)有嚴(yán)格分開(kāi)，往往會(huì)使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染，另一種情況則是提取原代細(xì)胞時(shí)在消化過(guò)程中由于剪割的組織塊不夠純，消化時(shí)間把握不好，容易把雜質(zhì)細(xì)胞消化混入原代細(xì)胞培養(yǎng)中。

二、預(yù)防細(xì)胞污染

1.室內(nèi)環(huán)境

(1)細(xì)胞培養(yǎng)室要有操作間、緩沖間和更衣室；

(2)房間裝修密閉性較高，且不宜開(kāi)設(shè)外窗，無(wú)菌間的房頂、墻壁和地面均應(yīng)光滑、無(wú)死角，室內(nèi)應(yīng)有紫外線殺菌裝置；

(3)實(shí)驗(yàn)臺(tái)和儀器布局應(yīng)合理。一般來(lái)說(shuō)，二氧化碳培養(yǎng)箱和凈化工作臺(tái)或生物安全柜不應(yīng)對(duì)著門擺放，離心機(jī)和顯微鏡不應(yīng)離得太遠(yuǎn)。

2.實(shí)驗(yàn)用品

(1)購(gòu)買合格的細(xì)胞，并留種凍存，必要時(shí)可將細(xì)胞懸液加入肉湯培養(yǎng)基或瓊脂培養(yǎng)基中，觀察是否有微生物滋生；

(2)細(xì)胞培養(yǎng)所用物品的清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細(xì)，操作室及剩余的無(wú)菌器材要定期清潔消毒滅菌；

(3)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中涉及到的自行配制的溶液要經(jīng)過(guò)高壓濕熱滅菌（如水、磷酸鹽緩沖溶液等）或0.22μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾（不耐高溫的溶液）、并檢測(cè)確認(rèn)為無(wú)菌后，方可使用；

(4)不同細(xì)胞在傳代或換液時(shí)所用器具應(yīng)嚴(yán)格區(qū)分，避免細(xì)胞間交叉污染。

3.實(shí)驗(yàn)人員

(1)操作人員進(jìn)培養(yǎng)室前，必須先洗手，在緩沖間換穿專用實(shí)驗(yàn)服和拖鞋，嚴(yán)禁在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)頻繁出入培養(yǎng)室；

(2)操作要準(zhǔn)確、敏捷、有序；

(3)吸取溶液時(shí)，應(yīng)專管專用，避免交叉污染；

(4)吸管管口要向下傾斜， 以防止液體倒流進(jìn)入移液器內(nèi)發(fā)生污染；盡量減少細(xì)胞和培養(yǎng)基的敞口時(shí)間；

(5)已開(kāi)口的試劑瓶盡可能的傾斜放置，防止下落微生物的污染；

(6)避免在敞口的細(xì)胞培養(yǎng)皿及培養(yǎng)皿蓋上方操作；不要面對(duì)工作臺(tái)或細(xì)胞培養(yǎng)箱講話或咳嗽，防止口腔微生物隨唾沫飛入而發(fā)生污染；

(7)若發(fā)生外溢，用蘸有消毒酒精的棉球及時(shí)擦去；

(8)實(shí)驗(yàn)后應(yīng)將實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的廢物和廢液及時(shí)清理出培養(yǎng)室，并清潔無(wú)菌工作臺(tái)。

三、結(jié)語(yǔ)

讀完了本文，您是否對(duì)細(xì)胞污染有了更多的了解呢？您知道應(yīng)該怎樣預(yù)防細(xì)胞污染了嗎？

之前Esco發(fā)過(guò)題為《如何保護(hù)您的培養(yǎng)細(xì)胞免受污染》一文，如果感興趣的話，可以前往我們的官網(wǎng)展開(kāi)了解，或者關(guān)注Esco生命科學(xué)的微信公眾號(hào)：Esco_China，進(jìn)一步了解更多關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)的相關(guān)內(nèi)容。