看如何利用自動細胞成像系統(tǒng)評價線粒體完整性和膜電位變化

簡介
線粒體功能作為細胞健康度評價的關鍵指標，可以通過檢測其膜電位變化情況獲得相應數(shù)據(jù)。線粒體膜電位去極化作為低氧損傷或氧化應激反應的早期重要的一種信號，陽離子熒光染料是用于線粒體膜電位評估的有效工具。我們利用兩種已知的氧化磷酸化抑制劑作為化合物進行短時間 ( 60分鐘 ) 的處理�？姑顾谹 (Antimycin A) 和氰氯苯腙 (CCCP)�；�合物處理后利用 MitoTracker Orange和細胞核染料分子進行染色，此實驗可直接檢測化合物對線粒體膜電位的影響。

方法
U2OS 細胞 (ATCC) 以 6,500 個每孔的密度預鋪于黑色底透 384 孔板中 (Greiner,black clear-bottom plates)，隨后第二天利用不同濃度的 Antimycin A 和 CCCP(Sigma) 處理 60 分鐘，每個處理進行三個重復，化合物 Antimycin A 起始濃度為100 μM 和化合物 CCCP 起始濃度為 50μM，稀釋比例為 1:3，經(jīng)過 30 分鐘化合物處理后，使用 MitoTracker Orange 和Hoechst 33342 染料 (Thermo Fisher,Carlsbad, CA) 對細胞進行染色，反應體

圖一：利用自動成像系統(tǒng)評價線粒體完整性和膜電位變化。ImageXpress Pico 自動細胞成像系統(tǒng)的20X 物鏡分別對 U2OS 質(zhì)控組細胞和 CCCP 處理后的U2OS 細胞成像后，利用 CellReporterXpress 軟件對圖像進行分析。左側(cè)：成像質(zhì)控組細胞和 1 μM 的 CCCP 處理后的細胞，MitoTracker Orange 染料 ( 桔色 )和 Hoechst 核染料 ( 藍色 ) 分子進行的染色處理；右側(cè)：成像分析綠色遮蔽為細胞核染色后結(jié)，白色遮蔽顆粒為線粒體。 細胞經(jīng)過氧化磷酸化抑制劑CCCP 處理后膜電位丟失

系于 PBS 中且最終各自的使用濃度分別是0.1 μM 和 6 μM。細胞染色過程于 37 ℃，5% 的 CO2 體系中 30 分鐘，對活細胞可直接成像分析或者使用 4% 多聚甲醛固定后在進行相應觀察。在室溫條件下使用 4%多聚甲醛經(jīng)過 30 分鐘左右時間對細胞進行固定，利用 PBS 緩沖液清洗 2 次，細胞直接在 ImageXpress Pico 自動細胞成像系統(tǒng)上使用 20x 物鏡進行觀察，圖像獲取采用每孔單點方式，利用其 DAPI 和TRITC 熒光通道且曝光時間分別為 20 ms和 300 ms。

客觀多參數(shù)分析線粒體完整性和膜電位的變化

如下圖一所示，質(zhì)控組細胞和氧化磷酸化抑制劑 CCCP 處理后的細胞，可以觀察到期線粒體完整性 ( 桔色 ) 有著顯著的差異，我們利用 CellReporterXpress 軟件預置的線粒體分析模板來評價其線粒體損傷。細胞核染色后確定單個細胞，分析發(fā)現(xiàn)每個細胞內(nèi)顆粒 ( 線粒體 )，可以采用多個參數(shù)進行結(jié)果分析，例如顆�？倲�(shù)、顆粒面積、每個細胞內(nèi)的顆粒數(shù)目、平均熒光強度和顆粒的整體熒光信號強度。結(jié)果以濃度效應學曲線展示出其 EC50 值，如圖二和表一所示。

結(jié)論
線粒體功能紊亂與各種疾病的發(fā)病機制有關，包括神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病，以及一些藥物的毒性作用和各種環(huán)境中化合物影響。這次實驗展示出 ImageXpress Pico自動細胞成像系統(tǒng)和CellReporterXpress軟件可在基于細胞學實驗應用方面，有效對線粒體膜完整性和電位的變化進行綜合
有效的評定。