環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的原理與應(yīng)用

原理與應(yīng)用

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）技術(shù)是日本學(xué)者Notomi T于2000年發(fā)明的一種新的DNA擴(kuò)增技術(shù)，該方法能夠高效、特異、快速的在等溫條件下完成。通過(guò)一系列的鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)，該方法能夠在1h內(nèi)就可以將靶基因擴(kuò)增109倍，當(dāng)靶基因?yàn)镽NA時(shí)，該方法還可以通過(guò)在反應(yīng)體系中添加反轉(zhuǎn)錄酶而實(shí)現(xiàn)對(duì)RNA的擴(kuò)增；在LAMP反應(yīng)中，會(huì)有大量的DNA合成，因此會(huì)產(chǎn)生很多焦磷酸根離子，這些焦磷酸根離子可以結(jié)合溶液中的二價(jià)Mg2+形成不容的焦磷酸鹽，便于對(duì)反應(yīng)結(jié)果的觀測(cè)，使擴(kuò)增和檢測(cè)一步就可以完成，大大提高檢測(cè)效率。

1.1 LAMP反應(yīng)的基本原理

該技術(shù)根據(jù)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)出4條引物，包括兩條內(nèi)引物和兩條外引物（如下圖），其中內(nèi)引物由靶序列正義鏈和反義鏈的兩個(gè)特異區(qū)域組成，利用DNA鏈在60-65℃的恒溫條件下處于解鏈和退火的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，在DNA聚合酶的驅(qū)動(dòng)下結(jié)合靶序列啟動(dòng)DNA合成，由于內(nèi)引物同時(shí)和雙鏈互補(bǔ)，因此是形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的主要因素；外引物與內(nèi)引物前端的序列互補(bǔ)，通過(guò)鏈置換DNA聚合酶的作用置換下內(nèi)引物合成的DNA鏈并且合成自身DNA，被置換的鏈自身形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)接著與內(nèi)引物結(jié)合進(jìn)行擴(kuò)增和鏈置換，新合成的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度是原來(lái)的二倍，如此經(jīng)過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增之后形成的產(chǎn)物是周而復(fù)始的插入靶序列的不同長(zhǎng)度的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA鏈，即由很多重復(fù)的環(huán)組成的花椰菜結(jié)構(gòu)。為了提高反應(yīng)速度，還可以通過(guò)引入兩條環(huán)引物加快反應(yīng)，環(huán)引物與合成過(guò)程中形成的環(huán)狀區(qū)域互補(bǔ)，增加了在LAMP反應(yīng)中DNA合成的起點(diǎn)數(shù)量，可大大縮短檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率。

R方法不同之處在于無(wú)需加熱到使雙鏈DNA解旋到兩條單鏈的變性溫度就可以驅(qū)動(dòng)反應(yīng)的進(jìn)行，針對(duì)靶基因的6個(gè)特性性區(qū)域的引物結(jié)構(gòu)如下圖所示，其具體合成步驟如下：

第1階段為起始階段：

第一步：內(nèi)引物FIP與模板鏈復(fù)性結(jié)合，以FIP引物中的F2區(qū)域3’端為起點(diǎn)，在Bst DNA聚合酶的鏈置換活性的驅(qū)動(dòng)下合成與靶序列互補(bǔ)的一條新鏈。

第二步：F3引物結(jié)合位于FIP前端的F3c區(qū)域開(kāi)始鏈置換DNA合成，將之前FIP合成的序列置換下來(lái)，同時(shí)與模板鏈相互配對(duì)，合成自身序列，形成以F3引物為起點(diǎn)的雙鏈DNA；被F3引物置換下來(lái)的鏈成為一條單鏈，由于這條單鏈上存在自身互補(bǔ)的序列，因此，F(xiàn)IP引物5’F1c區(qū)域與這條單鏈上的F1區(qū)域互補(bǔ)，自身配對(duì)形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。

第三步：下游引物BIP中的B2區(qū)域與被置換下來(lái)的這條單鏈相結(jié)合開(kāi)始DNA合成。通過(guò)這一過(guò)程，之前上游形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)恢復(fù)為線性結(jié)構(gòu)，隨后由下游的B3引物將其和成的單鏈置換下來(lái)；同時(shí)也進(jìn)行自身序列的合成，從而形成由F1到B3的雙鏈DNA。

第四步：被置換下來(lái)的單鏈DNA兩端分別與內(nèi)引物相結(jié)合，因而可以與自身配對(duì)在兩端分別形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，被稱(chēng)為啞鈴結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是LAMP擴(kuò)增循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。

第2階段是擴(kuò)增循環(huán)階段：

第一步：以上述的啞鈴結(jié)構(gòu)F1的3’末端進(jìn)行合成延伸，并且打開(kāi)5’末端的環(huán)。

第二步：以莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)為模板，F(xiàn)IP與莖環(huán)的F2c區(qū)結(jié)合，開(kāi)始鏈置換合成；同時(shí)3’末端B1c和B1區(qū)域互補(bǔ)，在3’末端形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，以自身結(jié)構(gòu)為模版，B1的3’端區(qū)域?yàn)槠瘘c(diǎn)進(jìn)行DNA合成，釋放出帶有FIP的互補(bǔ)序列。

第三步：上一步中形成長(zhǎng)短不一的2條新莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA，接著B(niǎo)IP引物上的B2與它們雜交，啟動(dòng)新一輪擴(kuò)增。

1.3. LAMP引物設(shè)計(jì)原則

LAMP技術(shù)擴(kuò)增基因的關(guān)鍵是設(shè)計(jì)出4條特異性的引物，從需要擴(kuò)增的靶序列中選出F3c、F2c、F1c、B1、B2、B3 六個(gè)特定的區(qū)域，利用在引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/e/)即可完成；在引物設(shè)計(jì)過(guò)程中，為了得到理想的引物，需要注意以下幾點(diǎn)：

00001. 被擴(kuò)增的靶序列長(zhǎng)度最好不要超過(guò)200bp。

00002. 內(nèi)引物的末端最好不要富含AT堿基對(duì)，其末端穩(wěn)定性自由能（△G）值應(yīng)該小于-4kcal/mol。

00003. 每條引物的Tm值應(yīng)該在55~65℃之間，最大限度的發(fā)揮酶的活性。

00004. 針對(duì)靶序列的各個(gè)區(qū)域，F(xiàn)2區(qū)域的5’到F1區(qū)域的5’末端以及B2區(qū)域的5’末端到B1區(qū)域的 5’末端之間的距離最好在40~60bp；F2區(qū)域的5’末端到B2區(qū)域的5’末端之間的距離最好在120bp~180bp。

1.4 LAMP反應(yīng)的結(jié)果觀察

LAMP在反應(yīng)過(guò)程中，由于其反應(yīng)效率高，速度快等特點(diǎn)，在反應(yīng)中dNTP會(huì)解離出大量的焦磷酸根離子，與溶液中的鎂離子相結(jié)合生成焦磷酸鎂白色沉淀，而焦磷酸鎂的生成量和DNA的擴(kuò)增量呈正相關(guān)，雖然普通的PCR也會(huì)產(chǎn)生焦磷酸鹽，但其生成量很少，不能用于結(jié)果觀察，因此，生成焦磷酸鎂白色沉淀是LAMP反應(yīng)所特有的，并且可以將這一特性運(yùn)用到反應(yīng)結(jié)果的檢測(cè)當(dāng)中去。

根據(jù)LAMP反應(yīng)的這一特性，可以在反應(yīng)體系中添加金屬離子絡(luò)合劑或金屬離子指示劑，通過(guò)其結(jié)合不同金屬離子而呈現(xiàn)不同顏色的這一特性來(lái)判斷反應(yīng)是否進(jìn)行。鈣黃綠素（Calcein）就是一中金屬離子絡(luò)合劑，它需要和熒光淬滅劑Mn2+一起使用，當(dāng)反應(yīng)體系中存在這兩種物質(zhì)時(shí)，隨著陽(yáng)性反應(yīng)的進(jìn)行生成大量的焦磷酸根離子，與鈣黃綠素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Mn2+，從而使Calcein缺少了Mn2+而開(kāi)始出現(xiàn)熒光，當(dāng)反應(yīng)結(jié)束后，陽(yáng)性結(jié)果為淺綠色；在紫外燈下顯熒光，而陰性反則顏色不變，仍為橙黃色。羥基萘酚藍(lán)（HNB）是一種金屬離子指示劑，當(dāng)溶液中存在Mg2+時(shí)，顏色為紫紅色，而隨著反應(yīng)的進(jìn)行，由于大量焦磷酸根離子的生成與Mg2+相結(jié)合，消耗了溶液中的Mg2+，顏色會(huì)由紫紅色變?yōu)樘焖{(lán)色；這兩種試劑都可以通過(guò)反應(yīng)體系顏色的變化來(lái)判斷反應(yīng)是否進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)對(duì)反應(yīng)的可視化觀察，大大提高了反應(yīng)的檢測(cè)效率。

LAMP反應(yīng)的結(jié)果是擴(kuò)增出不同大小的DNA片段，同樣也可以用最普通的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，向反應(yīng)產(chǎn)物中添加EB等核酸染料，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈照射下能夠觀察到大小不等的梯度條帶。

實(shí)時(shí)濁度法是利用實(shí)時(shí)濁度儀通過(guò)對(duì)反應(yīng)過(guò)程中溶液的濁度進(jìn)行測(cè)量從而實(shí)現(xiàn)對(duì)LAMP反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，可以在電腦上直接進(jìn)行結(jié)果分析，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)初始模版DNA量的定量擴(kuò)增；同時(shí)也可以對(duì)引物及其工作濃度，反應(yīng)時(shí)間、溫度等條件進(jìn)行優(yōu)化，從而為L(zhǎng)AMP反應(yīng)提供最優(yōu)的反應(yīng)環(huán)境。

2  LAMP檢測(cè)方法的應(yīng)用

LAMP技術(shù)自2000年出現(xiàn)以來(lái)，以其快速、精確、高效的特性經(jīng)被廣泛的應(yīng)用。這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到商業(yè)化的檢測(cè)試劑盒中，包括細(xì)菌和病毒的檢測(cè)；這項(xiàng)技術(shù)由于其成本低，能夠應(yīng)用于發(fā)展中國(guó)家的基層的實(shí)驗(yàn)室中，尤其是傳染病比較嚴(yán)重的地區(qū)。

Hara-Kudo 等建立了針對(duì)沙門(mén)氏菌的LAMP檢測(cè)方法，并且與PCR方法相比較，其敏感性要高于PCR方法；隨后，他們又針對(duì)大腸桿菌的VT基因建立了商業(yè)化的LAMP檢測(cè)試劑盒，實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌的LAMP檢測(cè)。Ito等報(bào)道了針對(duì)流感病毒的LAMP引物，建立了對(duì)流感病毒的LAMP檢測(cè)方法；該方法的敏感性好、特異性高。Imai等人建立了檢測(cè)禽流感H5型的RT-LAMP檢測(cè)方法；該方法第一次報(bào)道了能夠從野生禽類(lèi)咽拭紙樣本中檢測(cè)出H5禽流感病毒，并且不能夠?qū)θ肆鞲胁《镜腞NA進(jìn)行擴(kuò)增；其敏感性是普通RT-PCR敏感性的100倍。Nkouawa 等根據(jù) L 組織蛋白酶樣半肌氨酸膚酶基因建立絳蟲(chóng)的LAMP診斷方法，可以用于區(qū)分豬帶絳蟲(chóng)和牛帶絳蟲(chóng)以及亞洲帶絳蟲(chóng)。

由于病原微生物都有適應(yīng)和變異的功能，因此不斷會(huì)有新的感染性疾病的出現(xiàn)，能夠快速、高效、特異、便捷地鑒定出這些病毒，對(duì)疫病的防控就顯的尤為重要。LAMP檢測(cè)技術(shù)作為一種基于核酸擴(kuò)增的新的方法為鑒別微生物病原提供了很大的幫助，其操作方法簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短，只需要在恒溫的水浴鍋中就可以完成反應(yīng)，大大降低了檢測(cè)成本，該方法已經(jīng)在不同的領(lǐng)域針對(duì)不同的病原微生物取得了良好的效果，并且還有很多已經(jīng)開(kāi)發(fā)出來(lái)了相應(yīng)的LAMP檢測(cè)試劑盒，為疾病的鑒別診斷、預(yù)防控制做出了很大的貢獻(xiàn)。

RT-LAMP（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification）

LAMP也同樣適用于RNA模板，在反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶的共同作用下，實(shí)現(xiàn)RNA的一步擴(kuò)增，無(wú)需像RT-PCR，必須經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄過(guò)程。LAMP反應(yīng)溫度在60-65 ℃，在此溫度下AMV反轉(zhuǎn)錄酶同樣具有較高的活性，對(duì)于RNA模板，其反應(yīng)條件與DNA模版反應(yīng)條件相同，只需在反應(yīng)體系中加入AMV反轉(zhuǎn)錄酶；同時(shí)，也應(yīng)注意環(huán)境中的RNA酶對(duì)于RNA的降解作用，在進(jìn)行LAMP反應(yīng)之前RNA在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下首先合成cDNA，之后在Bst DNA聚合酶的作用下啟動(dòng)鏈置換反應(yīng)，開(kāi)始LAMP反應(yīng)。

尚碼生物本地寵物第三方檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，檢測(cè)速度快、結(jié)果準(zhǔn)、價(jià)格優(yōu)，歡迎送檢！